实验操作 | mIHC 实验流程 + 常见问题 (详细版) | MCE

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多重免疫组化 (mIHC)！额......和 mIHC 差不多的那个？是的，Buuuut！二者在具体实操中仍存在许多不同，嗯~就是那种~微妙的不同~让我们一起来看看吧~

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什么是 mIHC？

多重免疫组织化学 (Multiplex immunohistochemistry，mIHC)，也称为酪氨酸信号放大技术 (TSA)，通过在单个组织切片上同时染色多种免疫标记物，增强了单个组织切片中可观察到的信息量，因此可成为直接在肿瘤微环境中可视化细胞相互作用的有力工具[1]。

mIHC 的原理

图 1. 多重免疫荧光染色中酪胺信号放大 (TSA) 的机制[3]。

mIHC 借助不同的荧光染料标记，通过多轮染色实现组织或细胞的多靶点染色。利用二抗上带有的 HRP 来催化加入体系的非活性荧光素，以生成活化的荧光底物。活化的荧光底物可与抗原的酪氨酸共价结合，将信号以共价结合的方式结合到抗原上。这种分子结合产生的荧光信号比传统的免疫结合产生的荧光信号维持时间更久。后续进行抗修复洗去非共价结合的抗体，并暴露出抗原以进行下一轮的结合。待所有抗体孵育结束且荧光素都结合好后，对结果进行检测[2]。

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mIHC 完整实验步骤

图 2. 免疫组化（IHC）流程图。

样本制备

(1)取材：在采集动物或人体的组织样本时，需特别注意控制组织块的体积，使其保持在适当范围内，以确保固定液能够均匀且完全地渗透至组织内部。

(2) PBS /生理盐水冲洗：去除组织样本中带有的血液或者其他可能影响固定效果的体液。

(3) 固定：用 10% 福尔马林、甲醇、乙醇或者它们的混合液室温固定 18-24 小时，需要确保组织样本完全浸入固定液，避免出现未固定部分。

(4) 固定后处理：流水冲去固定液。

包埋

常用的包埋介质包括石蜡、树脂等。以石蜡为例。

(1) 脱水：酒精梯度脱水，用 75% 乙醇、85% 乙醇、95% 乙醇、无水乙醇 (I)、无水乙醇 (II) 分别浸泡 30-60 min，此时样本会变得不透明。

(2) 透明：用透明剂 (如二甲苯) 浸泡两次，每次 30 min 以去除酒精和其他溶剂。注意避免透明过度导至样本变硬易碎。

(3) 浸蜡：将经过透明处理的组织样本浸入熔融石蜡中，置于恒温箱内进行浸透，使石蜡充分而均匀地渗入组织内部。

(4) 包埋：将浸蜡后的组织样本放入模具，倒入熔化的石蜡。等待石蜡冷却凝固，避免过度冷却导至石蜡碎裂或组织变形。

切片

(1) 切片：将包埋后的组织样本用切片机切成 4-5 μm 厚的薄片。

(2) 展片烤片：用细毛刷轻柔地将切片从切片刀上分离，随后置于 40℃ 温水中使其充分展平，最后在 60℃ 条件下烘烤 2 小时以增强切片附着力。

脱蜡复水

(1) 脱蜡：依次使用二甲苯 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 进行梯度脱蜡，每缸浸泡 5 分钟。彻底清除石蜡对后续实验至关重要，任何残留都将干扰抗原暴露及染色效果。

(2) 复水：采用梯度乙醇（100% 乙醇 Ⅰ、100% 乙醇 Ⅱ、95% 乙醇、85% 乙醇、70% 乙醇）依次脱水，每级作用 5 分钟；最后经纯化水浸洗 5 分钟完成水化过程。注意需要避免干片，干片会导至非特异性抗体结合出现高背景。

抗原修复

通过抗原修复技术暴露被封闭的抗原表位，以增强抗体结合效率。热诱导抗原修复是最常用的方法，推荐使用以下修复缓冲液：柠檬酸盐缓冲液 (pH 6.0)、EDTA 缓冲液 (pH 8.0) 或 Tris-EDTA 缓冲液 (pH 9.0)。其中，EDTA 和 Tris-EDTA 缓冲液可以在柠檬酸盐缓冲液使用效果不好时使用，但需注意在高表达样本中可能产生非特异性染色。可以多尝试几种修复方法以达到最佳染色效果。

(1) 微波热修复：加入抗原修复液，放入切片，置于微波炉中火 8 min，停火 7 min，转小火 8 min；取出染色盒，冷却至室温。

(2) 水浴热修复：加入抗原修复液，放入切片，置于水浴锅中 95℃ 恒温 25-30 min (注意控制温度避免沸腾，以防组织脱落)。将样片与水共冷，不可骤冷避免快速降温导至抗原表位构象改变。

(3) 高压热修复：在染色盒中加入抗原修复液，放入切片，置于高压锅内加热至饱压后继续加热 5 min，关闭电源，10 min 后取出染色盒，冷却至室温。

(4) 酶解修复：常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶 K 等。将切片置于含有酶解液的载玻片上，然后在适当的温度和湿度条件下进行酶解 (通常为 37°C，20 min)。酶解后，同样需要冷却切片至室温再进行后续处理。修复后用 PBS 在摇床上洗 3 遍，每次 5 min。

图 3. 水浴热修复[5]。

阻断

(1) 阻断：采用 3% H2O2 溶液室温避光孵育样本 15 分钟，以消除内源性过氧化物酶活性，避免其对后续 HRP 显色系统的干扰。

(2) 洗涤：用 ddH2O 清洗切片两次，每次 5 min。用 PBS 在摇床上洗 1 遍，每次 5 min。

封闭

(1) 封闭：用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加封闭液，用封闭液 (5% BSA 或者血清) 室温或者 37℃ 孵育 30 min。

(2) 洗涤：用 PBS 在摇床上洗 3 遍，每次 5 min。

一抗孵育

(1)一抗稀释：选择合适的一抗，并用稀释液 (PBS、TBS 等) 稀释一抗至合适的比例。

(2) 一抗孵育：使用移液器将稀释后的一抗均匀覆盖样本区域，置于湿度平衡的孵育盒中，37℃ 恒温孵育 90 分钟以促进抗原-抗体特异性结合。

(3) 洗涤：用 PBS 在摇床上洗 3 遍，每次 5 min。针对易脱片样本，采用 37℃ 预温的温和洗脱缓冲液，轻柔洗涤 5-20 分钟，以维持组织完整性同时有效去除非特异性结合。

二抗孵育

(1) 二抗稀释：选择合适的二抗，并用稀释液 (PBS、TBS 等) 稀释二抗至合适的比例。

(2) 二抗孵育：室温孵育二抗 1 h，注意避光和干片。

(3) 洗涤：用 PBS 在摇床上洗 3 遍，每次 5 min。

TSA 染料孵育

(1) 稀释 TSA：用 1×TSA buffer 以 1:50-1:200 稀释 TSA 染料配置成工作液。染色液在室温下避光保存，最长可保存 24 h。

(2) 在玻片上滴加 100 μL 染色工作液，浸没样本，室温摇床上孵育 5-10 min，注意避免干燥。

(3) 洗涤：用 PBS 在摇床上洗 3 遍，每次 5 min。

抗体脱落

步骤同上述抗原修复步骤，目的是洗去已孵育的抗体。

冰冻切片/细胞爬片/骨组织 (容易脱片) 建议滴加适量 37℃ 预热至完全溶解的 mIHC 专用抗体洗脱液均匀覆盖样本，37℃ 放置  5-20 min，弃洗脱液，再次滴加适量抗体洗脱液均匀覆盖样本，37℃ 放置 5-20 min。

洗涤

ddH2O 洗一次，PBS 浸片 2 min。

重复

封片或者继续染色，可从步骤 "阻断封闭" 开始。重复步骤包括阻断内源性过氧化物酶—封闭 — 一抗孵育 — 二抗孵育 — TSA 荧光染料染色 — 抗体洗脱。

核染和封片

滴加 DAPI 工作液到样本上，室温孵育 5 min，PBS 洗涤一次，用抗荧光淬灭封片剂封片。长期保存建议用透明指甲油对盖玻片边缘进行密封。

镜检拍照

切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。

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mIHC 注意事项

(1) 建议在进行多重免疫染色前先通过预实验评估各抗体的染色效能，优先对染色信号较弱的靶抗原进行标记，再依次进行其他抗原的染色。

(2) 染料充分溶解混匀，表达高的一抗搭配弱光，表达低的搭配强光。

(3) 组织所包含细胞数应大于 1,000 个。

(4) 没有一种抗原修复缓冲液可以适用于所有抗原。不同的抗体可能需要不同的抗原修复方法和条件，因此需要根据实验要求和抗体特性选择合适的抗原修复方法。

(5) 实验过程中注意保持湿润状态，避免干片，易引起高背景或者出现阴阳片。

(6) 福尔马林固定的样本，对于石蜡包埋样本，应确保组织块完整性，无可见裂隙或结构破损。组织芯片 (TMA) 蜡块需保持包埋基质完整，避免切割或封固缺陷。载玻片上的切片应呈现连续完整的组织结构，无折叠或碎裂现象。

(7) TSA 荧光染料工作液 = VF 荧光染料 + TSA buffer；推荐荧光染料和 TSA buffer 的稀释比为 1:200；稀释比例可以根据具体情况灵活调整优化，最佳范围为 1:50-1:400；一般建议若一抗孵育时间常温 1 h-3 h 内，建议稀释比例 1:50-1:200，若一抗孵育时间 4℃ 过夜 (12 h 或以上)，建议稀释比例 1:200-1:400 或更高。

(8) 使用几种荧光素时，尽量选择相互之间无光谱交叉的荧光素，降低标记荧光强度，样品的一种或几种荧光强度太高，有时会导至光谱交叉出现。采用降低标记物浓度、缩短标记时间及调整荧光素介质等方法可降低样品荧光强度。

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mIHC 常见问题

Q多重染色试剂盒可以做细胞/细胞爬片样本吗？

可以的，但是每轮之间的修复建议换成抗体洗脱液。另外爬片不建议做五色以上，爬片多次修复会无信号反应。

AQ试剂盒对一抗二抗种属有要求吗？

支持 IHC-P，选择特异性高的一抗抗体。一抗种属尽量远离实际样本种属，避免二抗带来的非特异性。试剂盒内有搭配二抗，可以根据二抗来选择一抗的来源。多色的优势在于一二抗种属无需特别要求，一抗根据样本种属选择既可，二抗根据一抗选择即可，多个抗体组合，种属不会有影响。

AQ可以用同一来源的一抗进行染色吗？

可以的，TSA 的优点之一就是可以用于同一来源的一抗进行多重染色。

AQ是否可以用自己的二抗？

可以的，能够对应自己的一抗的 HRP 二抗就可以。

AQ标本切片有刀痕褶皱怎么办？切片易脱片怎么办？

切片有刀痕可换个刀口切片或者将蜡块置于 -20℃ 冰冻一会在切。切片有皱褶，要求捞片的时候片子充分展片，可在台灯下观察，展片温度控制在 40℃ 左右。切片容易脱片可将玻片用多聚赖氨酸处理，以增强粘附性。

图 4. 切片出现刀痕、褶皱。

AQ脱蜡不全，组织出现异染现象怎么办？

根据不同的室温，调节脱蜡的时间，原则是要彻底，干净。一般夏天室温高，脱蜡时间不需要很多 3-5 min 即可。冬天室温较低，脱蜡时间需要延长，10-20 min 或更长。

AQ如何降低非特异性染色？

缩短一抗/二抗孵育时间，稀释抗体比例。多克隆一抗容易出现背景，可以用单克隆抗体。内源性过氧化氢酶在肝脏和肾脏等组织含量较高，需要延长阻断时间减少背景。非特异性组分和抗体结合，需要延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间。适当增加 PBS 洗涤次数和时间。实验过程中防止干片。

AQ热修复每一轮都要做吗？

第一次染抗体之前的叫做抗原修复，是为了使被石蜡或者固定剂封闭的抗原决定簇重新暴露出来，使得抗体能够识别到抗原。在染后面几轮抗体之前的抗原修复，目的是为了去掉上一轮染色的抗体以及残留没有结合上的染料。如果是新鲜的冰切，可以不做抗原修复但仍需要阻断内源性过氧化物酶。如果是固定组织的冰冻切片仍需要做抗原修复，但是冰冻切片加热会有脱片风险，所以我们一般不建议固定样本的客户转做冰切。另外冰切样本可以用抗原洗脱液进行处理。

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mIHC 技术服务

mIHC 产品推荐-多重荧光检测试剂盒

mIHC MCE 承接服务

• 提供有偿代检和分析服务
  
  

• 承接多色配套服务
  
  

图 5. MCE 可提供的配套服务。

[1] Ross AB, et al. Proteome Turnover in the Spotlight: Approaches, Applications, and Perspectives. Mol Cell Proteomics. 2021;20:100016.

[2] Fornasiero EF, et al. Determining and interpreting protein lifetimes in mammalian tissues. Trends Biochem Sci. 2023 Feb;48(2):106-118.

[3] Aria Kaiyuan Sun, et al. Exploring Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Techniques and Histopathology Image Analysis: Current Practice and Potential for Clinical Incorporation. Cancer Med. 2025 Jan 7;14(1):e70523.

[4] Wei Chang Colin Tan, et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 2020 Apr;40(4):135-153.

[5] Aria Kaiyuan Sun, et al. Exploring Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Techniques and Histopathology Image Analysis: Current Practice and Potential for Clinical Incorporation. Cancer Medicine. 07 January 2025.

[6] Meitham Amereh, et al. Immunohistochemistry (IHC) staining of in-vitro cancer cell-generated tumoroids. MethodsX. 2023 Jun 3:10:102242.

[7] Oscar Maiques, et al. Multiplex chromogenic immunohistochemistry to stain and analyze paraffin tissue sections from the mouse or human. ScienceDirect. December 2022, 101879.