实验干货 | PCR技术原理及步骤

临床医师

咳咳，安静安静！今天，你“经验丰富但发际线堪忧”的师兄（强行挽尊）我，要给大伙儿说道说道PCR这门手艺。
当年我第一次接触PCR，那叫一个懵啊，看着protocol跟看天书似的。
但别怕，今天我把我的“血泪史”和“独门秘籍”都掏出来，保准让你听完之后，感觉PCR也就是那么回事儿，甚至有点……眉清目秀？
​ PCR到底是何方神圣？（简单粗暴版原理）
PCR，全称聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），说白了，它就是个“基因放大器”你想啊，茫茫DNA大海，想找条特定的序列，跟大海捞针似的。PCR，就能帮你把那根“针”变成一堆“钢筋”，让你想看不见都难
它是怎么做到的呢？主要分三步，但步步关键：

• 高温变性 (Denaturation)： 把你的DNA双链加热到94-98℃，Duang！氢键断裂，两条链“和平分手”，变成单链。把一根麻花拧开，也就这感觉了。
  
• 低温退火 (Annealing)： 温度降下来，通常是50-65℃。这时候，你精心设计的“狗仔队”——引物（primers）就出动了。它们是两条短短的DNA片段，专门识别并结合到你目标序列的两端。它们会像GPS一样，定位到你要放大的区域。
  
• 中温延伸 (Extension)： 温度再升到72℃左右，这是Taq DNA聚合酶（我们实验室都爱叫它“老司机Taq”）最嗨皮的工作温度。它会以引物为起点，用你加进去的“建筑材料”dNTPs（四种脱氧核苷酸），沿着模板链“咔咔咔”一顿复制，合成新的DNA链。
  

这三步循环个几十次（一般25-35个循环），你的目标DNA片段就能指数级增加。从最初的几根毛，变成一坨清晰可见的“DNA毛线球”。是不是很神奇？（此处应有掌声）
​ ️磨刀不误砍柴工：开干前的准备（别嫌我啰嗦）
俗话说得好，“工欲善其事，必先利其器”。PCR这活儿，准备工作做不好，后面哭都没地儿哭去。别问我怎么知道的，都是泪啊（T_T）。
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师兄的小贴士（防坑指南）： PCR区域一定要干净！干净！干净！（重要的事情说三遍）。 最好有专门的PCR操作台，移液器枪头啥的都用带滤芯的，防止气溶胶污染。 不然，你可能扩增出来的不是你的目标片段，而是你同事的、你自己的、甚至是空气中飘来的“神秘DNA”。 那种看到一堆杂带，或者阴性对照都亮瞎眼的绝望，谁试谁知道！

咱们看看都需要啥：
主要试剂和耗材 (Inventory Check!)

宝贝名称	干啥用的？	师兄的叨叨
DNA模板	你要扩增的“种子”	纯度、浓度是关键！别拿一坨粗提的玩意儿来糊弄酶，它会罢工的。
正向和反向引物 (Primers)	精准制导“导弹”	设计得好，一步到位；设计不好，原地爆炸（各种非特异性条带）。后面细说这玩意儿。
Taq DNA聚合酶	勤勤恳恳的“建筑工”	有各种改良版，耐热性、保真度各有千秋。选合适的，别选最贵的（老板看到这里可能会给我点赞）。
dNTPs mix	DNA的“砖头瓦块” (A, T, C, G)	浓度要够，不然“房子”盖一半就没料了。
PCR Buffer	给酶提供舒适的“工作环境” (pH, 离子强度)	通常带Mg2+，或者需要另外加。
MgCl2 (如果Buffer不含)	酶的“激活剂”之一，也影响引物结合	浓度很关键！高了杂带多，低了没产物，需要摸索。
Nuclease-free Water	稀释各种试剂，定容到最后体积	一定要“无酶水”！别用普通双蒸水，万一有DNA酶，你的模板就GG了。
PCR管/板	反应的“小窝”	薄壁的导热快，保证温度准确。用之前确认干净无污染。
带滤芯的枪头	防止交叉污染的“金钟罩”	答应我，做PCR一定用带滤芯的枪头，好吗？ 不然污染了哭的是你自己。

仪器设备 (The Big Guns)

• PCR仪 (Thermal Cycler)： 这就是那个能自动升降温的“烤箱”，PCR的核心装备。定期检查校准，不然温度不准，结果就飘了。
  
• 移液器 (Pipettes)： 一套量程齐全的移液器是标配。同样，定期校准，准确性是生命线！
  
• 微量离心机 (Minicentrifuge)： 把管壁上的液体甩下去，保证所有成分都在反应液底部混合均匀。
  
• 凝胶电泳系统： 跑胶看结果用的，后面会说。
  

​ 开干！PCR实操一条龙（手把手教学，包教…尽量包会）
准备工作就绪，咱们这就开整！
模板DNA的准备 你的DNA模板质量直接关系到PCR的成败。

• 纯度要高：OD260/280在1.8-2.0之间比较理想，OD260/230大于2.0更好。有杂质会抑制PCR反应。
  
• 浓度适中：一般基因组DNA用个几十到几百ng，质粒DNA用几pg到几ng就够了。太多或太少都可能出问题。我当年就试过加太多模板，结果条带糊成一片，老板以为我显微镜坏了（手动捂脸）。
  

引物设计与合成 一对好的引物，能让你事半功倍，直接高歌猛进。

• 长度： 一般18-25 bp。太短特异性差，太长退火效率低。
  
• Tm值： 两条引物的Tm值最好接近，一般差不超过5℃。Tm值通常在55-65℃。计算Tm值的公式和软件很多，比如Primer Premier, OligoAnalyzer (IDT)。
  
• GC含量： 最好在40-60%之间。
  
• 避免形成二级结构： 比如发夹（hairpin）、自身二聚体（self-dimer）、交叉二聚体（cross-dimer）。这些结构会跟模板竞争结合，或者直接产生引物二聚体小条带，烦人得很！各种在线工具可以帮你检查。
  
• 3'端要特别注意： 3'端是延伸的起点，最好是G或C，但要避免连续的G或C。3'端不要有互补序列，不然引物二聚体能亮瞎你的眼。
  

我当年为了设计一对完美的引物，对着电脑屏幕能看一天，各种参数调来调去。
设计好引物后，就交给公司合成纯化。
配制PCR反应体系 这一步就像配鸡尾酒，每种成分的比例都很重要。一般在冰上操作，防止酶在室温下提前失活。

⚠️ 注意加样顺序！ 通常的顺序是：Nuclease-free Water → PCR Buffer → dNTPs → 正向引物 → 反向引物 → DNA模板 → 最后加Taq酶！ 为啥酶最后加？因为它在室温下也有活性，太早加进去可能会导致非特异性扩增或者引物降解。 温柔点，把它当大熊猫对待。 ​

一个典型的25μL或50μL反应体系（具体浓度和用量请参考你所用试剂的说明书，这里只是举个栗子）：

• Nuclease-free Water: 加至最终体积
  
• 10X PCR Buffer (含Mg2+或不含): 2.5 μL / 5 μL
  
• dNTPs (各2.5 mM, 即10 mM total): 0.5 μL / 1 μL (终浓度200 μM each)
  
• 正向引物 (10 μM): 0.5-1.25 μL / 1-2.5 μL (终浓度0.2-0.5 μM)
  
• 反向引物 (10 μM): 0.5-1.25 μL / 1-2.5 μL (终浓度0.2-0.5 μM)
  
• DNA模板: X μL (按需调整，如基因组DNA 50-200 ng)
  
• Taq DNA Polymerase (5 U/μL): 0.125-0.25 μL / 0.25-0.5 μL (0.625-1.25 U / 1.25-2.5 U)
  

敲黑板！ 如果你的Buffer不含Mg2+，记得单独加MgCl2，常用终浓度是1.5-2.5 mM。Mg2+浓度是PCR优化中的一个重要参数，有时候需要摸索一下最佳浓度。
配好后，轻轻混匀（用移液器吹打几下，或者涡旋后短暂离心），确保所有液体都在管底。
设置PCR程序（指挥家的节奏） PCR仪的程序设置，就像给乐队指挥写乐谱，每个音符（温度）和节拍（时间）都要恰到好处。 一个典型的三步法PCR程序：

• 初始变性 (Initial Denaturation): 94-95℃，2-5分钟。彻底变性DNA模板，激活某些热启动酶。
  
• 循环 (Cycles, 通常25-35次):
  
  
  
  • 变性 (Denaturation): 94-95℃，15-30秒。
    
  • 退火 (Annealing): Tm值减去5℃左右开始摸索 (例如50-65℃)，15-60秒。退火温度是PCR特异性的关键！太低了杂带多，太高了没产物或者产物少。
    
  • 延伸 (Extension): 72℃，根据你的目标片段长度来定，一般Taq酶的延伸速度是1kb/分钟。比如你要扩增1kb的片段，就设置1分钟。
    
  
  
• 最终延伸 (Final Extension): 72℃，5-10分钟。确保所有PCR产物都完全延伸。
  
• 保温 (Hold): 4℃或12℃，直到你把样品取出来。
  

​师兄的独门秘籍：退火温度优化 要是你对退火温度没把握，可以用PCR仪的梯度PCR (Gradient PCR)功能。 一次跑8个或12个不同的退火温度，总有一个适合你！我当年就是靠这招，从“PCR杀手”变成了“PCR小能手”（自封的，不接受反驳（狗头））。

上机，然后……佛系等待
把PCR管或PCR板放进PCR仪，盖好盖子（热盖温度要设置对，防止蒸发），启动程序。然后嘛，你就可以去喝杯咖啡，刷刷文献或者跟聊聊天（注意保持实验专注度！）。等待PCR结果的心情，真的是堪比等彩票开奖，刺激！
​ 开奖时刻：结果咋看？（凝胶电泳与Troubleshooting）
PCR跑完了，是骡子是马，拉出来遛遛！最常用的就是琼脂糖凝胶电泳。
琼脂糖凝胶电泳基础 简单说，就是用琼脂糖做个“筛子”，DNA带负电，在电场作用下会往正极跑。分子量大的跑得慢，分子量小的跑得快。加点EB或者其他安全的核酸染料，在紫外灯下一照，DNA条带就显形了。 你要关注：

• 条带位置： 对照Marker（DNA Ladder），看你的条带是不是在预期的大小。
  
• 条带亮度： 亮度反映了DNA的量。
  
• 条带特异性： 是不是只有一条目标条带？有没有杂带？有没有引物二聚体（通常在最下面，<100bp）？
  

常见问题与“我当年的坑”（Troubleshooting精华）

• 啥也没有，一片漆黑 (No band or very faint band)：
  
  
  
  • 可能原因： 模板不行（降解、浓度太低、有抑制剂）、引物设计扑街、Taq酶失活、dNTPs降解、PCR程序不对（退火温度太高、延伸时间不够）、Mg2+浓度不合适。
    
  • 我的骚操作： 检查模板质量和浓度！重新设计引物（哭）。换新的酶和dNTPs。降低退火温度，延长延伸时间。优化Mg2+浓度。我甚至遇到过PCR仪坏了的（掀桌！）。
    
  
  

• 杂带丛生，像蜈蚣一样 (Non-specific bands)：
  
  
  
  • 可能原因： 退火温度太低、引物浓度太高、模板量太多、Mg2+浓度太高、引物特异性差、循环数太多。
    
  • 我的骚操作： 提高退火温度（梯度PCR大法好！）。降低引物浓度和模板量。降低Mg2+浓度。重新设计引物。减少循环数。有时候加点DMSO或者甜菜碱这类增强剂也能改善。
    
  
  

• 弥散拖尾，像彗星路过 (Smeared bands)：
  
  
  
  • 可能原因： DNA模板降解、上样量太大、酶的量太多、电压太高、电泳时间太长。
    
  • 我的骚操作： 重新提取高质量DNA。减少上样量。降低酶量。用合适的电压跑胶。
    
  
  

• 引物二聚体亮瞎眼 (Primer-dimers)：
  
  
  
  • 可能原因： 引物设计不合理（3&#39;端互补）、引物浓度过高、模板量太少。
    
  • 我的骚操作： 重新设计引物！降低引物浓度。增加模板量。使用热启动Taq酶。
    
  
  

​人间真实：

别看我说得头头是道，当年这些坑，我哪个没踩过？（此处应有我默默流泪的BGM）。
PCR就是个需要耐心和细心的活儿，多尝试，多总结，慢慢就有感觉了。
实在不行，就抱着结果去找老板/师兄师姐求助，别一个人闷头瞎搞，浪费时间又浪费钱（老板看到这句话可能会第二次打我）。
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​ PCR的星辰大海
​

咱们今天聊的只是最基础的PCR。实际上，PCR家族可庞大了去了：

• RT-PCR (Reverse Transcription PCR): 从RNA反转录成cDNA再进行PCR，研究基因表达的利器。
  
• qPCR (Quantitative Real-time PCR): 实时监测PCR产物的量，能精确定量DNA/RNA。这玩意儿现在简直是实验室标配。
  
• Nested PCR (巢式PCR): 用两对引物进行两轮PCR，提高特异性和灵敏度，适合检测痕量DNA。简直是“套娃”PCR。
  
• 还有各种修饰，比如高保真PCR、长片段PCR、多重PCR等等，玩法花样百出。
  

掌握了基础PCR，这些进阶玩法也就有了敲门砖。是不是感觉科研之路又光明了一点？
​师兄的赠言 & 小彩蛋
​
好啦，今天关于PCR就到这里。记住，PCR是个精细活儿，理论要懂，操作要细，心态要稳。遇到问题别慌，一步步排查，总能找到症结。
  师兄私藏福利时间！

• 引物设计好帮手：
  
  
  
  • NCBI Primer-BLAST: 在线检查引物特异性，比较香。
    
  • IDT OligoAnalyzer™ Tool: 功能强大，分析引物各种参数。
    
  • 等其他好用的工具，就不一一列举了。
    
  
  

• 遇到问题多查查： 很多试剂公司的官网都有详细的Troubleshooting指南，比如Thermo Fisher, Promega, NEB这些大厂。
  

希望今天的分享能让你们对PCR有个更清晰的认识。以后再PCR，是不是就有点“手拿把掐”的感觉了？（至少不会两眼一抹黑了对吧！）
祝大家的PCR实验都能一管出亮带，条条是真爱！ 下次有机会，再跟大伙儿聊聊别的实验技术。散会

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