PBJ | 重磅突破！豌豆CRISPR基因编辑效率首次达到100%，5个月搞定无转基因编辑植株！

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豌豆，这个被孟德尔用来发现遗传定律的经典植物，如今在基因编辑领域迎来了重大突破！
2025年6月1日，Plant Biotechnology Journal在线发表了法国巴黎萨克雷大学Alexandre de Saint Germain、Fabien Nogue团队的最新研究成果：‘’Efficient and heritable gene editing through CRISPR-Cas9 in Pisum sativum‘’，该研究成功建立了豌豆高效CRISPR-Cas9基因编辑体系，在转基因植株中实现了100%的基因编辑效率，并能在5个月内获得完全不含转基因成分的编辑植株。


豌豆基因编辑为何这么难？
作为全球最重要的豆科作物之一，豌豆不仅是人类和动物的重要蛋白质来源，更是遗传学研究的经典模式植物。然而，豌豆的基因编辑一直面临着三大技术难题：
转化效率极低：传统方法难以将外源基因导入豌豆细胞；
再生困难：豌豆根系再生能力差，基因型依赖性强；
编辑效率不高：缺乏先进的基因编辑工具应用。
这些技术瓶颈严重制约了豌豆分子育种和基因功能研究的发展。
四大创新策略突破技术瓶颈
研究团队针对豌豆转化和编辑的痛点，提出了四个关键的技术创新：（图1a）
1. 胚轴转化策略
不同于传统的叶片或愈伤组织转化，研究者选择使用胚轴作为转化材料。实验显示，几乎100%的胚轴都能在一个月内产生芽，平均每个胚轴产生2个芽。
2. 荧光标记快速筛选
创新性地使用DsRed荧光蛋白作为筛选标记，可以在3-4周内通过肉眼直接观察到稳定整合的转基因芽。这种非破坏性的检测方法比传统PCR检测更快速、更准确。
3. 嫁接策略克服生根难题
针对豌豆根系再生困难的问题，研究团队采用了巧妙的嫁接策略：将荧光阳性的芽接枝到野生型根砧上。这一策略的成功率高达90%，完美绕过了生根这一技术难点。
4. 优化的CRISPR系统设计

• 使用带内含子的zCas9i提高编辑效率
  
• 采用豌豆内源U6启动子驱动sgRNA表达
  
• 选择TENDRIL-LESS (TL)基因作为编辑靶标，该基因影响叶片形态，编辑后几周内就能观察到明显表型变化
  

100%编辑效率是如何实现的？
研究团队设计了两个sgRNA，分别靶向TL基因的第一个和最后一个外显子（图1c）。通过PsF2载体同时导入Cas9和sgRNA表达盒（图1b），实现了令人瞩目的结果：
所有荧光阳性的T0转基因芽都表现出预期的无卷须表型，编辑效率达到100%！
不同的T0植株产生了多种类型的编辑，包括小片段缺失和大片段缺失，表明不同的DNA修复途径参与了编辑过程。（图1d）
可遗传且无转基因残留
更令人兴奋的是，T1代分析显示所有生殖细胞都被编辑，产生了纯合子或双等位基因编辑的tl植株。
通过回交实验，研究者成功获得了不含荧光标记的F1植株，这些植株仍然保持着编辑表型（图1e），证明了编辑的稳定遗传性。这意味着可以在一个世代内就筛选到完全不含转基因成分的编辑植株。
安全性方面，研究团队对20个潜在脱靶位点进行了详细分析，未发现任何脱靶编辑，证明了该系统的高特异性。



图1

技术优势总结
相比现有方法，这套新技术体系具有显著优势：
效率高：转基因植株中编辑效率100%；
周期短：T0代几周内可观察表型，5个月获得无转基因编辑株；
可重现：在两个豌豆品种中都取得成功；
操作简便：荧光标记筛选，嫁接策略简单易行。
这项技术突破不仅为豌豆分子育种提供了强大工具，也为其他豆科作物的基因编辑奠定了基础。研究者指出，基于该技术的高效性和可预测性，碱基编辑和引导编辑等更精准的基因编辑工具也有望在豌豆中得到应用。
随着全球对植物蛋白需求的不断增长，这项技术将为培育高产、高品质、抗逆性强的豌豆新品种提供重要技术支撑，推动豆科作物育种进入新时代。
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