用于基于靶向的单细胞蛋白质组学分析的微流体系统

微流控芯片

在靶向蛋白质组学技术中，蛋白质是通过使用带有传感标签（如共轭荧光团、同位素标签或量子点）的亲和探针进行分析的，这些探针会发射或转导信号。为了实现高灵敏度并促进单细胞水平的靶向蛋白质组织学鉴定，微流体的使用越来越多，主要是因为它们提供了标记过程中更高的有效浓度、可控的细胞操作、大大减少的试剂消耗以及提高多路复用性和吞吐量的设计灵活性等优点。

基于细胞计量学的单细胞方法

流式细胞术（FCM）是一种标准的分析技术，通过量化单个细胞的荧光发射和散射光，每秒可以计数和分析数千个细胞。使用FCM和荧光抗体来分析细胞中的蛋白质一直是生物科学的主流和广泛应用。然而，FCM的细胞内空间信息有限，通常需要数十到数百μL的样本量。当将流式细胞仪缩小到微流体尺寸时，多参数测量的带宽会受到损害，例如，在高通量设置（>2000个细胞/秒）下表征细胞形态是一项挑战。为了解决这个问题，成像流式细胞术（IFC）结合了高通量FCM和高分辨率成像显微镜的优势，实现了细胞信息丰富的检测（图3a）。此外，IFC与微流体的集成允许简单的光学实现和对细胞操作的精细控制。请注意，在大多数IFC微系统中，流体通量和光学检测之间的权衡为在高通量下获得体面的空间分辨率带来了挑战。为了解决这个问题，Holzner等人引入了使用多色荧光和亮场分析的多参数IFC，该方法能够高分辨率和高通量地提取细胞形态特征，如准确的细胞大小和检测人类细胞中的细胞质蛋白。该方法将频闪照明（即一种为高速运动的物体生成无模糊图像的技术）与弹性惯性3D细胞聚焦相结合，分别有效地控制流速和细胞定位，从而实现每秒104个细胞的采集率。

FCM的主要局限性之一源于从荧光标记中检索到的信号的光谱重叠。为了解决这个问题，Bandura等人引入了质量细胞术（飞行时间细胞术（CyTOF）），该技术协同FCM和电感耦合质谱（ICP-MS），用于同时免疫检测单个细胞中约20种表面抗原。原则上，单细胞分析可以获得多达100个参数，因为约100种同位素可用于标记抗体。使用这种技术，细胞被用定制的多原子标签标记的抗体进行免疫染色，然后提交给ICP-TOF-MS分析。基于表面标记，单细胞CyTOF用于识别人类造血连续体中的异质性。 Porpiglia等人使用单细胞CyTOF对细胞表面标记和肌源性转化因子进行并发分析，从而能够解决肌源性隔室的异质性，并表征骨骼肌细胞中从干细胞到祖细胞的肌源性进展。为了解决DNA条形码的表型和分辨率有限的问题，Wroblewska等人开发了一种条形码系统，该系统在蛋白质结构域运行,促进了高维单细胞CRISPR筛查。通过这种方法，通过合成模块和编码线性表位的三重组合，生成了100多种蛋白质条形码（Pro代码）。随后对Pro编码转染细胞的表达载体进行CyTOF分析，仅使用14种抗体即可检测364个Pro编码群体。CyTOF也用于鉴定临床上重要的免疫重建。最近，Stern等人研究了人巨细胞病毒再激活不同阶段免疫重建的演变变化，这是异基因造血干细胞移植后的主要并发症。在这项研究中，CyTOF最大化了从有限样本量（就细胞数量和血容量而言）中提取的数据容量。一般来说，CyTOF比FCM更有利于多路分析。由于检测通道之间没有重叠，由于对样品基质的独立元素反应，可以进行绝对定量。

同时，FCM和CyTOF在处理单细胞悬浮液进行荧光时会丢失关键的空间信息。为了解决这个问题，通过将质谱仪扩展到成像质谱仪（IMC），设计了组织样本的单细胞分析，包括（但不限于）冷冻组织切片和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织。 IMC应用激光消融用同位素标记抗体染色的组织或组织切片，用脉冲激光扫描和汽化，并在质谱仪分析之前转移到ICP-MS检测。Jackson等人最近利用一个由35种生物标志物组成的IMC小组来量化癌症组织的临床样本。通过381张图像中约8.55×105个细胞的标记基因表达和单个细胞的空间特征，确定了肿瘤单细胞表型。单细胞IMC提供了空间分辨分析，这可能有助于研究表型异质性及其在肿瘤结构中的作用。目前，IMC面板的多路复用能力达到40个生物标记。为了挖掘2D IMC中无法检测到的信息，Kuett等人将空间分辨率扩展到3D，以便在TME中研究肿瘤侵袭。 Gerdtsson等人还证明了IMC与高清晰度单细胞分析（HD-SCA）检测的整合，该检测使用免疫荧光来表征沉积在载玻片上的数百万白细胞中的罕见肿瘤细胞。通过使用IMC，对HD-SCA鉴定的CTC内标记的亚细胞定位进行了液体活检的深入表型分析。

微蚀刻法

微重力法利用亚纳升孔捕获细胞，细胞分泌的蛋白质被预处理的载玻片捕获，载玻片上涂有亲和探针（抗体或抗原）。Love等人开创了微重力生物芯片，其中微孔是通过沉积细胞悬浮液制备的，使细胞在去除多余的未被追踪的细胞之前沉淀下来（图3b）。然后将刻有抗体或抗原的载玻片贴在封闭的单细胞上，并通过荧光免疫测定法检测分泌的蛋白质。Schubert等人开发了一种单分子阵列（SiMoA）平台，该平台能够对单个细胞中的少量蛋白质进行计数。SiMoA表明，前列腺特异性抗原的表达在前列腺癌症细胞中不同，并随着基因漂移而变化。Jia等人探索了微雕刻方法来研究非人灵长类动物对蛋白质结合疫苗的纵向回忆反应。自首次亮相以来，不断努力提高微雕刻方法的灵敏度，推动了从单细胞中检测低丰度蛋白质。Li等人介绍了一种在蛋白质检测中使用微孔平台的信号放大方法，其中光学的轴向分辨率（即深度场）得到了提高，侧壁和边缘捕获的荧光标签也对信号做出了贡献。与仅从平面发出荧光的传统微重力方法相比，值得注意的是，边缘增强微孔免疫测定将灵敏度提高了6倍。增强荧光的另一种方法是用半导体量子点代替有机染料，半导体量子点可用作荧光报告器来检测单细胞分泌的蛋白质。总之，基于微孔的检测比传统的酶联免疫吸附斑点（ELISpot）检测具有更高的灵敏度。此外，这种方法还具有适用于下游分析的细胞分离等优点，并能够通过多抗体雕刻的载玻片对单细胞分泌体进行动力学研究。

基于条形码的方法

希思小组开发的单细胞条形码芯片（SCBC）是分析单细胞蛋白质的首批基于条形码的方法之一。在该系统中，单细胞通过微流体处理，并在触发细胞分泌或裂解的微室中分离，目标分析物被“条形码阵列”捕获并荧光检测，其中各种DNA编码的抗体被涂覆在玻璃基板的预定区域上（图3c）。使用SCBC，从巨噬细胞和T细胞收集的10多种分泌蛋白的功能异质性通过微环境激活进行表征。自SCBC引入以来，人们一直在努力提高其检测性能，并扩展其在生物医学应用中的应用。例如，SCBC的应用通过获得药物状态和药物耐受状态之间轨迹的时间分辨特征，揭示了药物耐受的机制。Kravchenko-Balasha等人利用SCBC分析分离的胶质母细胞瘤脑癌症细胞的分泌蛋白。后来，多组学工作流程与SCBC整合：Xu等人测量转录物和裂解蛋白和Su等人通过与所选癌症标志物相关的细胞质蛋白和代谢产物研究了细胞异质性，这些标志物在早期药物反应过程中功能发生了变化。最近，Wang等人介绍了一种使用氧化石墨烯量子点（GOQD）的单细胞多指数分泌生物标志物分析方法；结果表明，GOQD组装的底物导至抗体固定密度提高了2倍（与聚赖氨酸底物相比），背景噪声降低了。多年来，SCBC已经配备了不断发展的微系统，导至多路复用性增加（>42种蛋白质），吞吐量提高（>1000个细胞），荧光分辨率更高。

赵等人还介绍了另一种基于多重原位标记（MIST）的条形码功能SCP策略，其中可以分析单细胞中的数十至数百个分子靶点。为此，在载玻片上对单层ssDNA-编码微珠进行图案化，与互补的DNA-抗体偶联物杂交，然后用含有单细胞的PDMS微孔封闭。通过荧光夹心ELISA，然后分析每种珠子，以检测数千个阵列中的特定蛋白质。这种方法的后续发展导至了单细胞循环多重原位标记（CycMIST）平台的出现，在该平台中，使用紫外线可切割的DNA条形码抗体来实现多轮标记和多循环解码过程，以实现高通量和灵敏度。高密度DNA阵列和小尺寸微孔的联合作用允许从单个细胞中检测到约180个蛋白质拷贝。

微流控毛细管电泳和单细胞蛋白质印迹

毛细管电泳（CE）是一种分析方法，其特点是使用高电场进行高分离效率和灵敏的离子检测。传统的CE存在分离时间长、样品消耗大和焦耳热耗散慢的问题。另一方面，微流体CE（MCE）能够解决这些局限性。MCE使用微通道在纳升尺度上对生物分子进行电泳分离，分析时间需要数十秒，可用于分离和检测从单细胞中提取的细胞内内容物。Huang等人开发了一种MCE，通过使用单分子荧光测量来检测单细胞中的低拷贝数（LCN）蛋白质。请注意，这种方法的吞吐量相对较低，多路复用能力有限。为了提高通量，Mainz等人利用光可编程和细胞可渗透的报告器同时分析单个细胞的激酶活性。Li等人还提出了一种基于多色荧光检测的微流体装置，用于单细胞操作，该装置提供了有效的电泳分离，以实现多个小分子的同时检测。总体而言，MCE利用短距离和相对较短的时间尺度，可以快速完成传统CE中采取的所有步骤。

微流体中使用的另一种电泳方法是A.Herr小组开发的单细胞蛋白质印迹（scWB），其中特定蛋白质的鉴定和定量取决于它们通过与抗体探针结合的薄层凝胶基质的迁移（图3d）。 scWB将蛋白质印迹与开放式微孔阵列相结合，从而提高了检测通量，并能够可靠地处理约2000个神经干细胞。请注意，scWB的早期发展主要集中在处理大量输入细胞，例如>1000个输入细胞，因此无法处理质量有限的输入细胞。为了解决这个问题，Sinkala等人将稀有细胞工作流程与scWB相结合，以分析单个循环肿瘤细胞（CTC）的蛋白质表达（复杂性=8）。具体来说，从患者血液中收集的细胞根据大小和变形性进行选择，对大有核细胞进行染色和鉴定，然后转移到微孔中。然后裂解这些细胞，将相关蛋白电泳注射到凝胶中，依次进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、印迹和免疫印迹步骤。最近，差异分级被整合到电泳分离中：特别是，J.Vlassakis等人通过电泳和免疫测定读数（SIFTER）引入了单细胞蛋白质相互作用分级，用于定量单细胞中的多聚体蛋白质复合物。在这项工作中，进行了双向电泳，单体和解聚的蛋白质复合物被分级并固定在微孔周围的凝胶区域，然后使用凝胶内免疫探针进行定量。除了高通量和负担得起的多重性的优点外，scWB还由于电泳分离而提高了抗体的特异性。

液滴微流体

液滴微流体技术能够通过在纳升体积的液滴中用荧光探针进行液滴包封来定量单个细胞释放的分泌体，克服了微流体FCM无法检测分泌蛋白的技术限制。液滴微流控技术也被用于分析细胞内蛋白质，其中一到三个细胞在液滴形成之前被电裂解。丁等人最近使用共流液滴微流技术将原代细胞（取自组织）与捕获微珠和荧光标记抗原一起包封（图3e）。在液滴培养过程中，所需的细胞（如B细胞）分泌第一抗体，以介导荧光团标记的抗原与微珠之间的结合。随后，通过荧光信号对被荧光抗原“标记”的所需液滴进行分选（图3e）。液滴微流控方法可实现高通量分析；然而，检测珠（在焦平面上）的排列使得对分泌的抗体进行定量变得具有挑战性。为了解决这个问题，通过在液滴产生后将热固性油的包封转化为固体来证明液滴的固定化。另一方面，Eyer等人引入了一种基于液滴的微流体技术（DropMAP），从固定在2D阵列上的液滴中引出单细胞分析。DropMAP能够实时测量以量化抗体分泌率、免疫亲和性和相关动力学。关于DropMAP的工作原理，包封了两个水相，其中一个包含细胞或校准抗体，另一个包含试剂（荧光标记和300 nm顺磁性纳米颗粒）。由于使用了纳米颗粒，抗体的结合能力得到了提高。当施加磁场时，纳米粒子（旨在捕获分泌的免疫球蛋白）交联，形成微米大小的聚集体。为了促进单个细胞在液滴内的封装并提高多路复用性，Khajvand等人将液滴微流体与抗体条形码集成在一起。使用约180 pL大小的腔室阵列来提高单细胞捕获效率（超过80%，存活率>90%），这种方法大大提高了固定液滴中单细胞的片上捕获、分离和长期培养。一般来说，基于液滴的微流体具有快速包封、提高靶浓度、减少样品之间的交叉污染以及桥接基因型和表型的能力。

总之，迄今为止讨论的微流体耦合靶向SCP方法清楚地展示了它们在推动基础和转化研究的关键生物学理解方面的潜力。尽管基于靶向的SCP方法由于需要亲和标记而具有内在局限性，但微流体和超灵敏生物传感方法的协同协调可能会补充基于MS的全局SCP不足的LCN蛋白质组领域。由于不存在一刀切的仪器，因此应从靶向和全局SCP交替检索的综合图谱应结合在一起，以说明基因组和相关蛋白质组之间的未知变异。

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