Science | 凝血与抗凝血的结构机理

营养师

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维生素K拮抗剂是最常用的处方药之一。在过去的半个多世纪，维生素K拮抗剂一直是使用最广泛的甚至是唯一的口服抗凝药物。这些拮抗剂被用来治疗或预防血栓相关疾病，比如肺栓塞、深静脉血栓和房颤引起的心肌梗塞、中风等。另一方面，婴儿出生时需要常规注射维生素K来预防自发性出血。维生素K和维生素K拮抗剂的广泛应用挽救了大量的有凝血功能障碍的新生儿和血栓病人。

维生素K拮抗剂用于血栓治疗有很长的历史。1954年，第一种拮抗剂华法林被批准应用于人体凝血治疗。尽管有将近70年的临床应用，人们对维生素K拮抗剂的机理却知之甚少。临床上，维生素K拮抗剂的最严重问题是剂量难以控制--用量不足会导致血栓，但过量使用很容易引起大出血甚至死亡。正因为这种大出血的特性，（超级）华法林同时还是最常用的杀鼠药。深入理解VKOR的催化机理及拮抗机理，将有助于开发更安全的维生素K拮抗剂的使用策略及更安全有效的药物。

活性态的维生素K是下游一系列凝血因子活化所必需的辅因子。产生它需要依靠维生素K过氧化物还原酶（vitamin K epoxide reductase，VKOR）。由于这个内质网膜上的酶保证了维生素K的循环利用，VKOR位于一系列凝血过程的上游。通过抑制VKOR活性，维生素K拮抗剂实现对活性态维生素K的量的控制，从而抑制下游凝血因子的活化来减少血液凝集。

近日，美国圣路易斯华盛顿大学栗卫凯课题组在Science杂志上以研究长文（Research Article）的形式提前在线发表了研究成果“Structural basis of antagonizing the vitamin K catalytic cycle for anticoagulation”，通过解析不同氧化还原状态的人源膜蛋白VKOR，河豚鱼同源蛋白VKORL与各种拮抗剂，底物的复合体共11个晶体结构，揭示了华法林等维生素K拮抗剂的作用机理及几乎整个维生素K催化循环的机理。






维生素K和拮抗剂的作用机理之所以未知，研究难点在于VKOR是一个特别不稳定的整和膜蛋白，一旦离开自然的膜环境就立即失活。为了克服这个技术困难，文章的第一作者刘世轩发明了一种膜蛋白尾端融合策略 （文章即将发表在Science Advances上)，加上配体共纯化，这样才成功的获得稳定的人源VKOR蛋白，并且采用脂立方相（lipid cubic phase,  LCP）结晶方法，最终得到了分辨率最高达2.0 Å的晶体结构。

晶体结构显示，VKOR蛋白结构的四个跨膜螺旋和位于内质网腔的顶盖区域共同形成了一个由大量疏水残基形成的活性中心。在这个疏水的“口袋”中，四种不同维生素K拮抗剂，包括世界上最常用的华法林，法国常使用的phenindione，超级华法林brodifacoum和chlorophacinone, 都同样通过两个关键的氢键分别与VKOR第139位的酪氨酸(Y139)和80位的天冬酰胺(N80)作用。这种疏水环境中的氢键形成了非常强的极性相互作用。突变这两个氨基酸残基，Y139F和N80A，都会产生华法林不抑制和导致病人的耐药性。
除了这两个氢键，四种拮抗剂疏水基团与组成疏水口袋的许多疏水氨基酸都有相互作用，其中最重要的是各种π-π相互作用。晶体结构还清晰表明，拮抗剂的拮抗能力差异与其疏水侧基与VKOR的结合能力相关。超级华法林Brodifacoum侧基团最大，而且与第二第三螺旋形成的通道中的氨基酸残基有较强的疏水性相互作用，所以在这四种拮抗剂中，抑制VKOR的能力特别强，无愧于其超级华法林的称号。华法林的代谢产物则不宜结合，解释了为什么细胞色素代谢酶也影响华法林剂量控制。

结构分析还发现，众多的氢键，盐桥等维系着顶盖区域的稳定。虽然它们与华法林并无直接相互作用，但是当氨基酸突变导致相互作用缺失时，会影响顶盖区域的稳定性从而影响华法林的有效性。这样，造成华法林等耐受性的氨基酸突变其实分为两类，一类与华法林直接相互作用，另一类则会导致维系顶盖区域的相互作用丧失。对于特定的个体，这个发现有助于改进华法林的用量的预测方法，真正有助于个人精准医疗。

没有配体的人源VKOR蛋白很不稳定，如何知道配体结合有没有导致VKOR蛋白的构像变化呢？作者们选择了自身比较稳定的来自于河豚鱼的高同源性VKORL蛋白。与VKOR-华法林的复合物结构相比，VKORL蛋与华法林的复合物结构几乎没有太大改变。
这说明可以通过研究VKORL来解释VKOR的作用机理。比较没有配体结合的VKORL结构和VKORL-华法林的复合物结构，发现蛋白质构像发生了很大变化，从开放构像变成了闭合构像。闭合状态的VKOR结构更为紧凑，这也解释了为什么人源VKOR蛋白有华法林等存在时比较稳定。重要的是，华法林和VKOR的局部相互作用诱导了这个蛋白总体构象的变化，

那么，底物是怎么与VKOR结合的呢？当纯化后的VKORL与不同氧化态的维生素K底物共结晶时，它们都进入不到活性中心的位置，而是微弱的结合在通道区域。只有当活性中心的半胱氨酸残基135（C135）处于还原状态时，这些底物能够进入到活性中心的位置。
这时候，C135与不同的底物形成电荷转移复合体（charge transfer complex，CT）或形成共价键。作者们用核磁共振实验佐证了底物-酶共价复合物的存在。在这两种情况下，VKOR的构像都处于闭合状态。这些说明，底物与酶的稳定结合需要C135处于还原状态，以形成底物-酶加成物，诱导VKOR的构像从开放转变为闭合状态。
更有意思的是，这种闭合状态直接诱导了巯基和二硫键的传导，保证了VKOR需要通过电子传递链来保持的催化活性。底物被还原后，C135处于氧化状态，底物被排挤出活性中心位置，通过通道区域释放出来；或者停留在通道中等待VKOR再次激活以进行下一步催化反应。
VKOR同时代表了一个大族的膜氧化还原酶，从植物和细菌里都有同源蛋白 -- 它们的功能是催化其他的蛋白的二硫键的形成和氧化性折叠。相对于细菌同源蛋白和别的家族的膜氧化还原酶，脊椎动物里VKOR这种底物诱导产生的整体构象变化还是第一次发现。所以，揭示VKOR整个催化循环对理解不同家族的膜氧化还原酶的作用也是一个重要突破。

与VKOR-华法林复合物结构相比，底物同样结合在VKOR的疏水口袋中，而且与同样的两个氨基酸残基Y139和N80形成强的氢键来帮助催化。这两个氨基酸残基的突变Y139F和N80A, 同样显著降低VKOR的催化活力。而且，如上所述，底物的结合同样的也诱导闭合构像。这些说明，华法林对维生素K的拮抗，是对底物与VKOR的局部相互作用及底物诱导的总体构象变化的双重模拟。

此外，晶体结构表明，华法林既能结合氧化态的VKOR, 也能结合半氧化态的VKOR。作者们以前的活细胞质谱研究表明，这两者占细胞中VKOR总量的90%左右 （NSMB, 2017)。但不同的是，维生素K在催化过程中只结合半氧化或还原态的VKOR。这些VKOR分子将随着底物的还原而被彻底氧化。
华法林结合能力很强，从而减少了能参与循环的VKOR酶的总量。同时，半氧化状态与华法林结合时，活性VKOR的量将会进一步减少。总之，这样独特的与氧化还原态相关的作用方式，加上局部结合和总体构象的双重模拟，赋予了华法林近乎不可逆的结合能力，极强的抑制能力和抗凝血功效。

这项研究是自1929年维生素K发现以来，首次从分子水平解释其催化转化机理。也是维生素拮抗剂近70年的临床应用后，首次清晰明确地揭示它们的拮抗机理。同时，这项研究揭示了临床上华法林耐受性和华法林代谢的机理，提供更多可以判断剂量的依据，朝着真正的个体化精准医疗迈进一步。
而且为更安全有效药物的开发提供了结构基础及新的思路。此外，从膜蛋白制备和结构生物学技术上说，此研究采用的尾端融合策略也为更多难以获得的不稳定蛋白，结构解析和蛋白质工程提出了新的解决思路。

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