【陈巍学基因】视频17：数字PCR

木吉火丁

数字微滴PCR（ddPCR）是一种新形的绝对定量PCR，其特点是灵敏度高、定量精确、检测的线性范围宽、特异性好、费用适中，是一种很有前途的分子定量检测手段。

本视频以Bio-Rad公司的数字微滴PCR为例，介绍了此项技术。

本视频时长10分钟，建议在Wifi条件下观看：

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欢迎来到【陈巍学基因】。我们这个节目，主要是给大家介绍基因组学和临床分子诊断最新技术进展。

今天，我们会谈一下数字微滴PCR，也就是dropletdigital PCR，缩写就是ddPCR。

传统的荧光定量PCR，经过多年的发展，已是很成熟的实验方案了。其中，最常用的是Taqman法和SYBR Green法。而在这二种方法当中，Taqman法又以其特异性高、定量精确，得到广大用户的认可。

但是Taqman法PCR，它还是一个相对定量的办法。它测的是一个Ct值，也就是PCR到第几个循环，荧光强度达到了一个设定值。

要想用Taqman方法得到：样本中到底有几个目标基因的拷贝，那么还是要再做一个标准品的（qPCR）曲线。才能知道样本的Ct值落在标准曲线的哪个位置上。再进一步推算出样本中的拷贝数量。

这样做，它首先要做一个标准曲线，那么，当然它就增加了工作量。另一方面，因为引入了标准品，而标准品也多少是有一定误差的。所以，实验中又多引入了一个实验的误差变量。

科学家为了克服传统定量PCR的上述两个弱点，那么又新发明了微滴数字PCR。

微滴数字PCR的原理，就是把原来一整管的PCR反应液，分散成几万个，甚至几百万个极微小的液滴。这些小微滴同时进行PCR反应，这样就可以计算出原来的反应液当中，有多少个目标基因的拷贝了。

了解了原理之后，我们来看看商业公司的实现方案。其中Bio-Rad公司和RainDance公司采用了油包水PCR的方法，用油把PCR反应液分隔成等体积的小液滴，再进行PCR反应。Life公司采用了芯片的方法，在芯片上预制了2万个小孔，把PCR反应液，物理地注入到芯片上的小孔中，密封后，进行PCR反应。

在本期的视频当中，我们将以Bio-Rad公司的仪器和方法为例，来介绍ddPCR。

在实验过程当中，首先，每个样本，准备20微升的反应液，反应液当中，含有与常规Taqman法一样的探针、样本、酶、dNTP、和缓冲液。反应液加在专用的塑料载片（cartrige）上。

在这个载片上，有三排孔，每排是8个孔。中间一排是放反应液的。上面一排是放油的。

这两排孔，都通过底下的预制的微孔管路，连接到第三排孔。这样，这个载片上就可以放8个反应液。

放油的这个孔，可以放70微升的专用的油（微滴发生油）。

然后，这个载片放到仪器（微滴发生器）当中。仪器把油和水同时挤进下面的特制的微孔管路中，挤出来就形成油包水的乳浊液，进入第三排孔中。

这个油包水的乳浊液当中，每个水滴的直径是125nm。一个样本，产生2万个微滴。

制备好的乳浊液放到普通的PCR仪中，做40个PCR循环。

在PCR进行的过程当中，如果一个微滴当中有一个、或更多个目标基因片段，Taqman探针就会被酶给切碎，荧光基团和淬灭基团分离。在后面的检测过程当中，荧光基团被激发光照了之后，就会发出荧光。

如果一个微滴当中没有目标的基因片段，那么Taqman探针就不会被切碎。在后面的检测过程当中，荧光基团吸收到激发光的能量，还是会被淬灭基团所淬灭。那么这个微滴的荧光水平，只会保持在本底水平。

40个PCR循环完成之后，就用读数仪（reader）进行读数。

在开始制备乳浊液的时候，大约是产生2万个微滴。在实验过程中，因为挂壁、转管原因，会损失一部分的微滴。PCR反应完成之后，用针把乳浊液吸到计数仪当中进行读数，这里面也会有一定的死体积（针和管路内的体积），这样，又会损失一部分的微滴。这样，最后能够读到的微滴数大概是14,000~16,000个微滴。

在读数的过程当中，微滴依次地通过扫描仪（中的毛细管）。这个和用流式细胞仪来读细胞的荧光，是差不多的道理。

读数仪会把读到的信号记录下来，进行分析。其所记录的信号，是红色荧光的光强，和绿色荧光的光强。也就是说，一个微滴会有2种颜色的荧光信号（红色和绿色）被记录下来。

读数仪读一个样本的时间，大约是2分钟。

对于读到的信号，仪器进过计算，给出每微升的反应液当中，有多少个目标基因的拷贝数。

机器也可以给出每个反应当中，有多少个目标基因的拷贝数。

因为一个反应是20个微升，所以，一微升当中有多少个目标基因的拷贝，和一个反应中有多少个目标基因的拷贝，是20倍的转换关系。

这里，我们要说明一下，并不是说一个样本中检测到了几个亮点，这个反应当中就有几个目标基因的拷贝。因为目标基因的片段，在微滴当中的分布，是符合泊松分布的。也就是说一个发光的微滴中，可能有一个目标基因的拷贝，也可能有2个、甚至3个、4个，或者更多个目标基因的拷贝。

所以，发光的微滴数与原始的基因拷贝数，并不是一对一的对应（线性）关系。每个液滴当中平均含有的目标基因拷贝数（Copyper droplet,CPD）和阳性微滴比总的微滴（数）的关系公式：CPD ＝ - ln(1-P)。

这其中CPD，就是Copy Per Droplet的缩写。也就是一个微滴当中，平均有几个拷贝，

P是阳性微滴比总微滴的比例数。 “ln”就是以自然数“e”为底的对数。

ddPCR的检测中，对基因拷贝数变化最敏感的这个浓度，是在CPD为1.6时，是最灵敏的。

也就是说，在差不多平均每个微滴当中，有1.6个拷贝的目标基因片段时，目标基因拷贝数的变化，可以被最精确地检测到。

所以，在实验过程当中，如果样本中目标基因的拷贝数过高，可以考虑通过稀释的方法，把反应中的基因拷贝数稀释到甜点（CPD= 1.6）符近。也就是差不多一个微滴当中，有1.6个拷贝，这样一个浓度。

目前Bio-Rad的检测的误差范围在约10%左右。检测的动态范围，大约是10的5次方。

根据Bio-Rad公司专家的经验，如果是用人的较完整基因组DNA来做基因突变频率的实验，一次一个样本加66 ng的DNA，成功率是比较高的。如果是用石蜡样本中回收的DNA，来做同样的基因突变频率的实验，建议每个孔中可以加330ng的DNA。这样，成功率是比较高的。之所以石蜡样本DNA要加得多一些，是因为石蜡样本中大部分的DNA都是严重降解的，它并不能作为良好的PCR模板进行反应，所以要多加一些DNA，以弥补模板的DNA量。

目前，用Bio-Rad公司的仪器、试剂做ddPCR反应，大约一个反应，所消耗的试剂和耗材的

成本在5到6个美金。

ddPCR在生命科学当中，已有了许多实用的应用。它包括：

1、肿瘤的个体化医疗

2、遗传学、和表观遗传学研究

3、基因表达量差异的分析

4、病原微生物的检测

5、食品安全、转基因成份的分析

6、环境微生物的检测

7、高通量测序文库的质量控制等

可以预计，未来会有更多、更新ddPCR应用，被科学家发明出来。

Bio-Rad中国公司的产品专家陈寅清先生，为本期节目提供了大量素材、和资料。在此向陈寅清先生表示感谢！

来源：陈巍学基因微信号