结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒创新体外诊断试剂注册技术审评报告

一、产品概述

（一）产品主要组成成分

*不同批号试剂盒组分不可混用。

（二）产品预期用途

本试剂盒用于体外定性检测人舌拭子样本中的结核分枝杆菌复合群核酸。

（三）产品包装规格

48测试/盒。

（四）产品检验原理

本 产 品检 测 的 靶基 因 为结核分枝杆菌复合群（Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC）基因组中的插入序列IS6110和 IS1081，内标为管家基因GAPDH基因。本产品采用荧光 PCR 技术，选取结核分枝杆菌基因组中相对保守的区域，设计特异性引物及探针，在样本提取之后采用荧光 PCR对MTBCDNA进行检测。

本产品采用了 Taqman 荧光探针技术，其试剂比常规PCR试剂多了一个寡聚核苷酸探针，这个探针带有一个荧光发光基团和一个荧光淬灭基团，完整的探针在特定光源激发下，发光基团所产生的荧光被淬灭基团全部吸收，样品无荧光。PCR过程中，Taq 酶在延伸 DNA 链的同时，可通过自身的5’→3’核酸外切酶活性降解与模板结合的特异性荧光探针，使荧光报告基团与淬灭基团分离，分离后的荧光报告基团在特定光源激发下产生荧光。通过监测整个 PCR 过程荧光信号的变化，对未知模板进行定性分析。

同时采用内标质控体系，用于监测反应体系可能存在的抑制因素。

二、临床前研究概述

（一）主要原材料

1、主要原材料的选择

原材料包括MTBC引物探针、Taq荧光预混试剂、MTBC靶点质粒、IC质粒，原材料均为外购的方式获得。其中引物、探针、质粒由申请人自行设计，由合成公司经过合成和纯化后获得。

申请人对原材料进行了供应商的选择，通过功能性实验筛选出最佳原材料和合格供应商，制定了各主要原材料质量标准并经检验合格。

2、企业参考品和质控品的设置情况

申请人设置了企业参考品，包括阳性参考品、阴性参考品、最低检测限参考品和精密度参考品。

阳性参考品 4 份，由目标病原体培养物组成。阴性参考品10份，由试剂盒检测范围外不同病原体培养物或常见干扰物质组成。最低检出限参考品 1份。精密度参考品2份，由不同浓度的目标病原体培养物组成。

申请人还设置了阳性质控品和阴性质控品，用于检测过程中试剂和仪器的质量控制。

（二）生产工艺及反应体系研究

申请人通过对试剂主要生产工艺的研究，确定了最佳生产工艺。

申请人对样本采集及样本预处理方式、样本投入体积、核酸提取流程、样本洗脱体积进行了研究。同时对反应体系的引物探针浓度、反应体积、样本体积、各阶段温度、时间和循环数等进行了优化和验证，最终确定了最佳的反应体系。

（三）分析性能评估

分析性能包括准确度、精密度、最低检出限、分析特异性、包容性等。申请人提交了有效运行的质量管理体系下生产的三批产品，在适用机型上进行的分析性能评估资料。

在准确度研究中，申请人采用三批试剂盒检测企业参考品，结果显示：阳性符合率和阴性符合率均为100%，精密度参考品和检出限参考品均满足要求。另外通过对临床样本进行检测，结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）的灵敏度、特异性均满足要求。

在精密度研究中，申请人采用三批试剂盒，对不同浓度（弱阳性样本、中等阳性样本）的阳性样本和阴性样本分别评估了批内精密度、批间精密度、中间精密度、再现性等研究。结果显示：阴性样本均为阴性，弱阳性样本的阳性检出率高于95%，中等阳性样本检出率为100%且两个靶标的Ct值的CV值均≤5%，表明本产品的精密度良好，符合设计要求。

在最低检出限研究中，采用三批试剂盒进行建立和验证，以阳性检出率≥95%时所对应的浓度作为试剂盒的最低检出限，并进行最低检出限验证。经最终确定本试剂盒的最低检出限为20CFU/mL。

在包容性研究中，申请人采用三批试剂盒，选择不同来源的结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌进行了包容性研究，结果表明试剂盒包容性满足性能要求。

分析特异性研究包含交叉反应研究、干扰物质研究、竞争性干扰研究、口腔常见定植菌的干扰研究。在交叉反应研究中，与浓度为106  CFU/mL的非结核分枝杆菌复合群的堪萨斯分枝杆菌、苏加分枝杆菌、海分枝杆菌、龟分枝杆菌、土地分枝杆菌、偶发分枝杆菌、次要分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、戈登分枝杆菌、胃分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、草分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌无交叉反应。本试剂盒检测以下病原体，包括肺炎链球菌（106CFU/mL）、金黄色葡萄球菌（106 CFU/mL）、流感嗜血杆菌（106CFU/mL）、星状诺卡氏菌（106CFU/mL）、大肠杆菌（106 CFU/mL）、铜绿假单胞菌（106  CFU/mL）、表皮葡萄球菌（106  CFU/mL）、白色念珠菌（106CFU/mL）、格特隐球菌（106CFU/mL）、烟曲霉（106CFU/mL）、人类副流感病毒（1、2和 3型）（ 105PFU/mL）、人流感病毒A型（107copies/mL）、人流感病毒B型（105PFU/mL），检测结果均为阴性，无交叉反应。

在干扰试验中，申请人对内源和外源干扰物质进行了研究。结果显示：外源性药物：异烟肼、盐酸乙胺丁醇、利福平、吡嗪酰胺、卡那霉素、阿莫西林、扎那米韦、肾上腺素、地塞米松、莫匹罗星、链霉素、贝达喹啉、利奈唑胺、氯法齐明、含氟牙膏、漱口水、硫酸沙丁胺醇吸入气雾剂、沙美特罗替卡松吸入粉雾剂（沙美特罗/丙酸氟替卡松）、西瓜霜**等不会对检测结果产生影响。内源性干扰：人全血（30%V/V）、人细胞

（1.23×106cell/mL）、白蛋白（10μg/mL）、粘蛋白（1.81 mg/mL）不会对检测结果产生影响。

申请人对口腔常见定植菌以及口腔中可能存在的食物残渣和烟草等干扰物进行了研究，结果表明不会对检测结果造成影响。

在竞争性干扰试验中，申请人在病原体临界阳性水平进行研究，结果显示与结核分枝杆菌复合群近缘的17种常见物种和与肺结核有相似症状或混合感染的15种常见物种对本试剂盒检测结果无干扰。

（四）阳性判断值或参考区间研究

申请人采用本产品和配套仪器对收集的 204例临床样本进行检测，获得试剂盒各个检测通道的Ct值，通过对相应样本的数据分布进行统计分析确定样本的阳性判断值。然后进一步采用91例临床样本进行阳性判断值验证，结果显示确定的阳性判断值符合率良好。

（五）稳定性研究

申请人对产品实时稳定性、使用稳定性、运输稳定性以及样本稳定性进行了研究，确定了在各种条件下本产品及样本的有效保存时间。

实时稳定性：使用企业参考品对三批试剂按照技术要求检

测。结果表明试剂盒在-25℃-15℃条件下，试剂盒有效期为12个月。此外，申请人对产品的使用稳定性、运输稳定性以及样本稳定性分别进行了研究。结果显示，产品的性能均能满足产品说明书的声称内容。

三、临床评价概述

申请人在首都医科大学附属北京胸科医院、新乡医学院第一附属医院、广西壮族自治区胸科医院、南宁市第四人民医院、内蒙古自治区第四医院共 5 家机构进行了临床试验。采用试验体外诊断试剂与数字PCR法、痰液培养鉴定以及痰液Xpert检测进行比较研究。

与数字PCR 的比较部分，共纳入722例受试者，均为疑似肺结核患者，样本类型均为舌拭子。试验结果显示，该产品与数字PCR的阳性符合率为98.63%（95%CI:96.53%，99.63%），阴性符合率为98.84%（95%CI：97.31%,99.62%）。并分别针对IS6110和IS1081两个靶标进行了评价，均具有较好的一致性。

与痰液培养鉴定的比较部分，共纳入 664例受试者，其中培养鉴定为结核分枝杆菌复合群阳性的患者为 211 例。试验结果显示，该产品与痰液培养鉴定对比灵敏度为89.10%（95%CI:84.09%，92.96%）。针对与痰培养不一致的部分，均结合临床诊断结果、其他检测方法等进行了充分分析。

申请人同时开展了试验体外诊断试剂与诊疗过程中同一患者痰液样本Xpert检测结果的比较研究。共纳入 651例患者，其中痰液Xpert检测为阳性的患者共280例。试验结果显示，该产品与痰液Xpert的阳性符合率为95.71%（95%CI:92.63%，97.77%），阴性符合率为94.88%（95%CI：92.12%，96.89%）。

试验结果显示，试验体外诊断试剂与数字PCR、痰液培养鉴定、痰液Xpert检测均具有较好的一致性。

综上所述，试验体外诊断试剂的临床试验资料符合技术审评要求。

四、产品受益风险判定

（一）受益评估

结核分枝杆菌复合群包含结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌。除田鼠分枝杆菌对人无致病力外，其它三种菌均可对人致病，是结核病的病原菌，可通过呼吸道、消化道和破损的皮肤粘膜进入机体，侵犯多种组织器官，引起相应器官的结核病，以肺结核最常见。我国是全球30个结核病高负担国之一，每年新发结核病患者89.5万例，因此，结核病成为制约我国社会经济发展的重大公共问题之一。早诊断、早隔离、早治疗是减少肺结核发病和死亡的关键环节。本产品临床应用的主要受益在于：采用分子生物学方法，检测人舌拭子样本中的结核分枝杆菌复合群核酸，用于肺结核病的辅助诊断。对于临床上较难获得痰液样本的患者，有利于提高结核分枝杆菌复合群核酸的检出率。依据现有的临床试验结果，本产品对结核分枝杆菌复合群核酸检测的临床灵敏度和特异度良好。

（二）风险评估

申请人对已知危险（源）进行风险评价，按照风险可接受准则判断每个危险(源）的风险是否达到可接受水平，对合理可行降低的风险、不经过风险/收益分析既判定为不可接受的风险采取控制措施，并对具体措施进行实施验证，同时重新对采取措施后的风险进行估计，确认其风险水平可接受。但为保证用械安全，基于对主要剩余风险的规避，需要在说明书中提示以下信息：

1.本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/病史、其它实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

2.当检测样本被检核酸浓度含量低于最低检测限时可能会有假阴性结果，阴性结果仅能说明低于本试剂盒检测限值，不能完全排除感染的可能，此时建议采用其它方法进一步确认。

3.本产品不适用于肺外结核患者的辅助诊断。

4.警示及注意事项：该试剂盒说明书中明确了该试剂盒检查方法的局限性及使用中的注意事项。