RNA提取常见问题集锦

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一、实验前的准备
1、要了解你的实验室环境，了解你的实验环境中可能存在的隐患：是否有同事在进行DNA抽提？是否实验室人员众多？
2、要了解你可以使用的设备：离心机是否可以低温操作？破碎、匀浆的条件怎样？
3、要了解抽提RNA的目的。
4、要了解样品的采集、制备、保存的条件，了解样品的特点。
有了充分的了解后，才能正确选择合适的方法/试剂，提高抽提的成功率。  
二、RNA抽提“三大纪律八项注意”
纪律一：杜绝外源酶的污染。
注意一：严格戴好口罩，手套。   
注意二：认真处理实验所涉及到的试剂、耗材、环境。
纪律二：阻止内源酶的活性。
注意三：选择合适的匀浆方法。   
注意四：选择合适的裂解液。   
注意五：控制好样品的起始量。   
注意六：匀浆操作快速而彻底。
纪律三：明确自己的抽提目的   
注意七：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下
降。   
注意八：RNA抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不
是得率。
三、RNA抽提的10大窍门
1：快速阻止Rnase活性–样品收集后快速冷冻，裂解时快速操作灭活Rnase。   
2：选择合适的抽提方法–高核酶含量的组织，脂肪组织最好用含苯酚的方法。   
3：预判质量要求– Northern，cDNA文库构建对完整性要求高，RT-PCR, RPA (Ribonuclease protection assay)对完整性要求不是很高。RT-PCR对纯度(酶抑制物残留)要求很高。   
4：彻底匀浆是提高得率和降低降解的关键。   
5：检查 RNA的完整性–电泳检测，28S:18S =2:1是完整的标志，1:1对大部分实验也是可以接受的。   
6：去除DNA –用于RT-PCR, array analysis最好用Dnase I去除DNA。   
7：降低外源酶的污染–不能从外面又导入酶。   
8：低浓度的核酸浓缩时，要加入助沉淀试剂。但要防止助沉淀剂含酶及DNA污染。  
9：彻底溶解RNA，必要时可以65C加热5分钟。   
10：合适的保存方法–短时间可以–20C保存，长期请保存于–80C。
四、提高RNA得率的方法
1：使用更有效的破碎/匀浆方法。RNA如果不能被有效释放出来，得率是会降低的。液氮捣碎、酶消化破壁(Lysozyme/Lyticase)、电动匀浆器匀浆，虽然麻烦，但都是获得高得率的有效手段。  
2：抽提试剂的更换。假如得率低不是由匀浆方法不彻底引起，则可能是所使用的试剂的裂解能力差导致。最合理的做法是：使用更多的裂解液；用完后换厂家。另外，可以改用不使用苯酚/氯仿抽提的试剂/方法；使用苯酚/氯仿抽提的方法，由于不可能全部取出上清，RNA的损失是比较大的。   
3：延长沉淀时间。如果核酸浓度低，采取低温沉淀、并延长沉淀时间，可以获得非常好的效果。
五、不同抽提总RNA方法的比较




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