western blot 经验分享

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western blot真的是一个让人又爱又恨的实验，毫无疑问它能很直观的检测蛋白的表达情况，但是整个实验步骤繁多，时间线拉得很长，这就导致了整个实验稳定性不好，而且一旦出错，去检查是哪一个步骤出了毛病会非常的麻烦。小鱼的话现在是一个大四本科生，做wb的话做了有三年多吧，可能零零散散百次还是有了，也已经参与发表了两篇sci，希望有些经验能够帮友友们避开一些雷区，如果有说漏的地方欢迎评论区补充，废话不多说了直接开整。
ps：如果是新学的朋友，第一步先把整个实验流程理顺，在大脑中形成一个基本架构，做了上一步知道下一步干嘛就行，然后最好知道每一步的意义是什么，这样方便实验出问题的时候排错。接下来我开始逐步说明每一步中我所知道的细节，仅供大家参考，实际实验还需要结合自身情况哦。
1.做wb的目的是为了检测蛋白表达情况，所以这一步所有人都绕不开第一步——提蛋白，制样。

先要把蛋白从组织/细胞/临床标本中提取出来，提取的过程中注意低温防止蛋白降解，条件允许的话往裂解液里加入蛋白酶抑制剂。如果需要检测磷酸化蛋白那么则需要加入磷酸化物酶抑制剂。ps：如果需要检测磷酸化蛋白酶的话可以考虑把pbst换成tbst，tbst配置出来需要调一下ph值，有些偏碱。
关于裂解液的选择与蛋白提取过程中特别操作就一起说了因为有共通的地方，核心思想是要先了解好自己检测的蛋白是什么东西，是否有什么特性，从这个方面来寻找它的适合方法。这样说的话可能尚未有一点抽象，我就举几个例子来简单说明一下：
比如：sox-2，是一种膜上的蛋白那么我首先需要考虑的就是，裂解液一定要能充分的吧细胞的膜结构进行裂解，这样蛋白才能释放出来到溶液中去。然后摸蛋白的话一般就可以辅助以超声破碎仪进行细胞破碎，提取的效果好一些，如果实在蛋白表达量很低，而其他蛋白有干扰的话，那就考虑一下中细胞膜蛋白提取试剂盒，当然，细胞核蛋白提取试剂盒同理，但是我属于比较穷的买不起试剂盒。同理如果你提取的是细胞核内的蛋白，那你就还需要考虑细胞核膜的一个破碎情况，印象中sds（十二烷基硫酸钠，以前好像也有人叫啥十二烷基磺酸钠），np40，应该是都能破碎细胞核膜的，但是前者的性质要烈一点，这里用是因为后续用于wb实验，如果需要保留蛋白活性的朋友慎用sds。
提蛋白就先讲这么多，要展开讲细节实在太多了。还得考虑蛋白的溶解性啊，定量一定要定齐啊，loading buffer成分配比啊（有钱直接买的当我没说）等等。。。做实验之前其实都需要考虑进去。
2.跑好一次wb的最基本保障——制胶。

首先是制胶用的试剂，最理想的情况是，老板有钱，可以直接买商品化的制胶试剂，那就很棒，出了问题你一般都不需要去考虑是不是自己试剂有问题，但我不属于那种情况-_-#。接下来给大家说说穷人家的孩子是怎么过的，除了temed，其余试剂几乎全自己配。百分之30丙烯酰胺配的时候记得避光，过滤。6.8/8.8配的时候把ph值调准确了，不要用试纸，直接上酸度计就OK了。aps配了之后过个滤，完事给分装一下，一次用量不大的话就拿1.5的ep管分装，冻去-20，不要反复进行冻融。然后试剂的话基本就没啥了，就照着配方配，该冻起来冻起来就完事。
然后就是制胶的过程，玻板一定一定一定要洗干净哦，最好洗洁精洗一遍，自来水冲掉泡沫，然后再用ro水完全冲一遍，洗干净之后烘干表面水分，上装置的时候，一定一定要卡紧了。（如何观察卡没卡紧呢？你在上好之后一只手轻轻摁住装置。另一只手手指抓着玻板两端轻轻左右摇动，如果说装置跟它连成一体移动，玻板没有松垮垮的感觉，也没有和装置产生相对运动，一般认为此时就是可以的）加了下层胶之后记得用异丙醇或者ro水压一下胶哦。如果出现一种情况，就是它漏了但是又没完全漏，就漏来下层胶的高度勉强还可以接受，那这种胶可以用吗？理论上来说，可以，但是，不建议使用，因为漏胶可能会造成胶内部凝结时不均匀，相比于一点自己配的免费试剂，我不会拿自己的蛋白样品去浪费。上层胶插梳子的时候从一边往另一边插，赶走液体里的气泡。
接下来说一说制胶凝固的时间问题，我老师当初告诉我的是，下层胶凝久一点，上层胶很快，他说得倒也没有错，事实上上层胶确实凝固的很快。如果你身处的实验室并不是恒温的，那凝胶的时候注意一下环境温度。（30度以上，一个小时到一个半小时就差不多了，≤30度的时候，凝久一点，2小时往上走，如果时间允许的话。）还有就是，胶凝固了不等于胶凝固好了，所以上层胶我也会凝结半小时左右，以期胶体的内部结构比较稳定，还有就是制好的胶最好放一放在用，我一般是头天晚上制胶第二天跑电泳，中间这晚上给泡在ro水里放在冰箱四度。
3.蛋白分离——电泳。

这算是这个实验的一个主体部分了，但其实这部分反倒细节没有那么多。
还是老样子，试剂讲起走。有钱直接买，没钱自己配也行反正电泳缓冲液配起来也简单不大可能会配错，溶解sds的时候耐心一点，不要把磁力搅拌器转速开太大，不然全是泡泡。
安装装置的时候，把两个玻板给安稳了，不要让里面的液体往外漏，去拿样品出来之前安装好，然后把里面给加满电泳缓冲液，一直到上样的时候液面没有下降那就OK。然后拔梳子的时候，手稳一点，别歪了，实在歪了，其实用注射器的针尖给它弄回去也不是不行，但是这属于是骚操作，不建议。
样品从冰箱里拿出来之后，用金属浴加热几分钟，（95度）然后拿去涡旋混匀仪上混匀一下，如果样品差一点点够上样，那就找个微型的ep管离心机，把管壁上的甩下来，但是别离心久了。上样的时候尽量用精准一点的移液器，艾本德我蛮喜欢的可惜买不起我一般借别的同学的用。然后蛋白样品你往孔里面加的时候，可能枪头尖上会有那么一点点残余，可以这样操作：吸起蛋白样品往孔里面加的时候，先尽量往孔底伸，然后蛋白打出去沉降一下后，把枪尖上移一些，稍微离你刚才打的蛋白远一点，然后手松开，吸一些电泳缓冲液上来，再打进去，一定要轻哦，别把蛋白冲起来。重复几次，最后一次打出的时候就按到第二停点，并把移液器枪尖抬出液面，完事。
然后就是正式开始跑电泳了，我通常是80/120的恒压跑电泳，有心的同学也可以留意一下电流情况但我一般没咋管因为这一步没啥严重发热。转电压的时机嘛，大家也公认的是maker出红色条带后嘛，其实晚点也问题不大，但是如果你蛋白没跑齐到一根线上那切忌提前转电压哦。然后就是电泳跑到哪种程度停止，这个问题的话，看你要检测的蛋白分子量大小了，如果大的话，就多跑一会，比较小那就要注意着别跑穿了。ps：制胶那一步没有讲什么分子量对应什么胶浓度的问题，友友们自己查阅哦，这属于比较基础的问题。如果在蛋白跑了一半的时候里面装置漏液怎么办呢？把外面装置也给填满电泳缓冲液就OK，如果觉得浪费你也可以选择乌鸦喝水——往里边放冰袋，但是你的电泳或许会因为低温的原因跑得慢一点。（说来其实有可能低温情况下的电泳效果会更好一些不知道是不是小鱼自己的错觉）
4.转膜

用什么规格的膜小伙伴们根据自己需求选择，通常好像是有0.22和0.45。至于pvdf膜还是nc膜，有钱就用pvdf膜，但是nc膜似乎可以用丽春红染蛋白听起来也不错（小鱼没用过）。其实这一步反倒是没什么说的，注意恒流时的电压，有个区间的，别太高也别太低了。然后就是要注意温度，一定要低温，温度一高效果就不太好。膜和胶之间一定不能有气泡，膜与滤纸，胶与滤纸之间也不要有。然后就是千万注意方向别转反了！做一天实验下来发现自己把蛋白转到滤纸那边去了很容易崩溃的哟，而且这个错误可能很多人都犯过。
然后封闭的话我就在这一起讲了，因为本来也没啥好讲的，注意有蛋白那面朝上就是，37度摇床封闭1h，时间长了就用pbst洗一下。
5.一抗二抗，

封闭完了就是切条带孵一抗了，（ps：千万别把蛋白切掉了哦，注意蛋白在电泳的时候实际位置与maker指示的位置可能有一些上下沉浮，要多留一点空间出来。）这一步其实主要是取决于你抗体的质量了，操作都没啥说的，蛋白面向上，四度孵育过夜（16h），一抗完成用pbst跑着，上摇床洗三次每次五分钟，如果孵的比较久那就洗久一点；二抗常温孵育一个小时，孵育完成久pbst洗等待曝光，同理孵育的久那就多洗一会。
6.曝光

曝光久很简单了，就俩字，耐心，enmm注意一点把发光液涂均匀。然后曝光的时候一定要选择能明显看出蛋白变化趋势的图片保存下来，最好淡的浓的中等的都保存一下，我反正因为这个被老板骂了好久。
7.结果分析：略                                       略略略=_=

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