疏水层析理论知识

千姿百态

一. 疏水层析的概念及原理：
1. 疏水层析分离的概念早在1948年由Tiselius提出真正发展是1970年开发出一系列适合疏水层析的固定相以后。
2. “疏水作用”一词是Kauzmann于1959年在“蛋白质进展”杂志中提出的，随后陆续有学者发表用疏水层析成功分离蛋白质的文献报道;如钙调蛋白苯丙氨酸裂解酶、凝集素等。
3. 1972年，Erelz等人将不同链长的a，w一二胺同系物键合在琼脂糖上，以不同pH的含盐缓冲液作流动相成功纯化了糖原磷酸化酶，开始确立了疏水层析在分离纯化某些疏水蛋白质、肽类等生物大分子的重要作用。
4.疏水层析的原理完全不同于离子交换层析或凝胶过滤层析等技术，使该技术与后两者经常联合使用来分离复杂的生物样品;
5.目前该技术主要应用领域是在蛋白质的纯化方面成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。


二. 疏水层析原理：
1.疏水层析亦称疏水作用层析(hydrophobic interaction chromatography，HIC)，是利用盐 -水体系中样品组分的疏水基团和固定相的疏水配基之间的疏水力不同，而使样品组分得以分离的一种层析方法。从分离纯化生命物质的机制来看，它也属于吸附层析一类。
2.利用被分离组分分子表面的疏水微区、(可逆)变性后暴露出的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子表面的疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作用强弱，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分离开。
3.高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。


三. 疏水层析与反向层析
①.在用液相层析分离时，能满足疏水特性的有两种不同模式:疏水层析和反相层析。
②.是1950年由Howard和Martin建立的。
③.“反相”:主要是与“常相”相反;
④.“常相层析”:是一种使用亲水固定相和含有己烷或氯甲烷等有机溶剂作为流动相的技术。
⑤..反相层析中，固定相是疏水的，所以使用了水/有机溶剂作为流动相使用。即固定相比流动相更加疏水。


四.反向层析
①. 与基质结合的配体密度大，疏水性强，对蛋白质类物质具有较大的吸附力。
②. 欲将吸附物解析下来，须用含有机溶剂的流动相(降低极性)洗脱，方可见效
③. 洗脱液的极性降低，常常会引起大分子活性物质变性
④. 因此反相层析一般较适合分离纯化小分子质量的肽类和辅基等物质

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/392477374