胶体金法免疫层析技术原理及研制方法总结（以新冠为例）

Rose

一、胶体金试纸条组成及检测原理




X病毒IgG抗体检测原理：将重组 X抗原用胶体金标记，分散固定于结合垫(金垫)上；检测线固定抗人球抗体，而质控线则固定抗 X病毒抗原的单抗或多抗。当使用该试纸检测待检样品时，结合垫中标记的重组 X抗原首先与样品中的待检抗体结合并开始侧向流动，带标记的抗原-抗体复合物流动到检测线时，待检抗体与抗人球结合，最终在检测线上呈现标记抗原聚集显色。未被拦截的标记抗原被质控线上的抗 X病毒抗原的抗体拦截并聚集显色。最终，阳性样品的检测结果为检测线和质控线同时显色，而阴性样品的检测结果只有质控线显色。
X病毒IgM抗体检测原理：将重组 X抗原用胶体金标记，分散固定于结合垫(金垫)上；检测线固定抗人IgM抗体，而质控线则固定抗 X病毒抗原的单抗或多抗。当使用该试纸检测待检样品时，结合垫中标记的重组 X抗原首先与样品中的待检抗体结合并开始侧向流动，带标记的抗原-抗体复合物流动到检测线时，待检抗体与抗人IgM结合，最终在检测线上呈现标记抗原聚集显色。未被拦截的标记抗原被质控线上的抗 X病毒抗原的抗体拦截并聚集显色。最终，阳性样品的检测结果为检测线和质控线同时显色，而阴性样品的检测结果只有质控线显色。
  X病毒抗原检测原理：制备检测抗原的试纸时，将特异识别待检靶标的鼠源抗 X病毒单克隆抗体，用胶体金标记物标记，制备含特异性金标抗体的结合垫；在检测线固定特异性识别待检抗 X病毒抗原的多克隆抗体；质控线固定兔抗鼠特异性IgG的抗体。当检测待检样品时，结合垫中金标抗 X病毒单抗与样品中的待检抗原结合形成抗原-金标抗体复合物并开始侧向流动。当泳动到被检测线时，被多克隆抗体拦截并聚集，在检测线上呈现标记抗体聚集显色；而未被检测线拦截的金标抗体及部分抗原-金标抗体复合物被指控线拦截并聚集显色。最终抗原阳性样品的检测结果检测线和质控线同时显色，而阴性样品的检测结果只是质控线显色。

结果判定：



阳性：在检测线（T）处，质控线（C）处，各出现一条紫红色条带，判定为阳性，表示样品中含有相应抗原/抗体。
阴性：在质控线（C）处，出现一条紫红色条带，检测线（T)处未出现一条紫红色条带，判定为阴性，表示样品中不含相应抗原/抗体。
无效：在检测线（T）处，质控线（C）处，都无明显条带出现，判定为检测结果无效。

试剂条各部分作用：
⑴样品垫：检测样本滴加位置，对检测样本具有一定的过滤和缓冲作用，降低样本中离子强度或者酸碱度对检测结果的干扰。
⑵金垫：将胶体金标记抗体通过干燥固定在玻璃纤维素膜上，是追踪抗体与抗原的反应。
⑶硝酸纤维素膜：膜上预先包被上检测线和质控线，能够与胶体金标记物发生免疫反应相结合，使胶体金在检测线发生聚集，根据检测线的显色状况进行判读结果。
⑷吸水垫：通过吸水作用使液体样品向上流动，带动金垫上的金标抗体向上移动，从而与检测线的抗原发生反应。

胶体金的结构
  胶体金是由一个基础金原子核与包围在外层的负离子层（AuCl2-）构成，呈球形(小颗粒)或椭圆形(大颗粒)。胶体金颗粒最外层可以吸附大量的正离子，能够均匀的分散在溶液中。



胶体金的性质
（1）外观：随着胶体金粒径的逐渐增大，胶体金溶液的颜色从橙色逐渐变为紫色。

粒径（nm）	颜色
2-5	橙黄色
10-20	酒红色
30-80	紫红色

（2）特性：由于胶体金表面呈负电性，能够与表面带正电荷的蛋白（抗原、抗体）通过静电作用结合进行标记。

二、抗原抗体的前处理
原则：无不溶物、低盐，过量盐可使金颗粒发生凝集。
1） 蛋白质应先用低盐浓度缓冲液透析，去除盐类成分。
2） 用微孔滤膜或超速离心除去蛋白质溶液中的细小微粒。
常用透析液有2mM硼酸PH9.0或10mM的PB缓冲溶液PH7.4，但有些蛋白不稳定，透析后沉淀析出，应通过试验选择既可保证蛋白稳定又低盐不影响胶体金标记的缓冲液。

三、胶体金的制备和标记  

（1）容器的清洁
  容器表面的污染会干扰金颗粒的生成，所有容器使用前经过酸洗。反复使用的器皿以金溶液润洗后超纯水淋洗即可。
（2）金颗粒制备
  取0.5mL 1%氯金酸，加入到49.5mL超纯水中，置于100mL圆底烧瓶内，磁力搅拌加热至沸腾，使用注射器、一次性0.22μm过滤器迅速一次性加入预热的适量 2%二水合柠檬酸三钠，继续搅拌煮沸15分钟，关闭磁力搅拌器，冷却进行金颗粒检测。
（3）金颗粒检测
肉眼观测溶液呈酒红色，分光光度计扫描吸收值，要求在521nm±2nm附近有最高吸收峰。

制备方法（还原法）：采用还原剂将氯金酸（HAuC14）还原成胶体金，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。我们采用的是柠檬酸钠还原法。







氯金酸（HAuC14） 加热煮沸加入柠檬酸钠 胶体金溶液

（4）胶体金标记条件摸索
最适pH摸索方法：取 200μL EP管或者酶标条，分别加入 100μL 胶体金，每管加入不同体积的 0.2M 碳酸钾，然后分别加入1mg/ml的抗原或抗体，室温下放置10-15min，最后各管加入一定体积10％ NaCl溶液，混合，室温下放置10 min，离心观测。
最适标记量摸索方法，将胶体金加入最适碳酸钾以后，加入梯度抗原或抗体，再加入10%NaCl进行离心观测，确定最适标记量。最适合标记pH和最适标记量往往需经多次试验才能确定





(5)制备方法
  于50mL离心管中，取10mL 胶体金，加入一定量 0.2 M 碳酸钾（不同抗原或抗体加入碳酸钾的量需要摸索来确定），混匀后加入一定量抗原/抗体（不同抗原或抗体加入的量需要摸索来确定），迅速混匀，室温标记30分钟，加入BSA至室温封闭30分钟，最后在标记金溶液中加入蔗糖，完全溶解后进行铺金作业。

四、金垫与样品垫的预处理
生产量大时可以整张样品垫和金标垫处理，干燥后切割，生产量小时则按照生产量先切割再处理，将金标垫、样品垫、吸水垫、衔接胶带切割成以下大小：



样品垫、金标垫处理
将样品垫、金标垫铺满处理液，样品垫37℃±2℃干燥12-24小时，金标垫37℃±2℃干燥2小时，干燥标准为样品垫、金标垫无潮湿、软化现象即可。

五、划膜、组装、切条、包装  

(1)划膜液配制
  准确称量磷酸氢二钠1.15g、磷酸二氢钠0.23g、适量甲醇于50mL离心管中，加入纯化水溶解，再补加纯化水定容至1000mL，过滤除菌2~8℃保存备用。
(1)划膜：
  将NC膜粘贴在底板中间位置，与不干胶纸位置完全一致。将质控线液和检测线液在NC膜上划质控线和检测线，质控线划在距膜顶端12.1±0.1cm处，检测线划在距膜顶端12.5cm±0.1cm处，质控线与检测线相距5mm±1mm。37℃±2℃干燥12-24小时。
(2)稀释液配制
  称量氯化钠1g于500mL烧杯中，加入50mL 处理液，补加纯化水定容至100mL，过滤除菌，2~8℃保存备用，取样进行半成品检定。
(3)大板粘贴、切割
将包被NC膜、吸水垫、金标垫、样品垫、衔接胶带，按顺序依次重叠2mm粘贴在底板上，制成大板，然后试切几条4mm宽的试纸条，进行半成品检定。检定合格后进行切条。






将裁切好的检测条压入检测卡壳内，配上干燥剂装入铝箔袋内，并密封好，并将鼻咽拭子、采集管装入包装袋内。下图是市售新型冠状病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）成品。



六、总结



七、优点
方便：检测不需依赖仪器设备；
快速：5-15分钟即可获得检测结果;
灵敏：检测限可达到ng/ml;
现场：不受场地要求限制，可随时随地进行检测；
大批量：能够同时检测大量样本。
效期长：室温可保存2年