实验技巧 | Western Blot实战经验汇总

与光同辉

1、转膜不充分


(1)膜没有完全均匀湿透

使用100% methanol浸透膜。

(2)靶蛋白分子量小于10 000

选择小孔径的膜，缩短转移时间。

(3)靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值

可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH 10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液。

(4)甲醇浓度过高

过高甲醇浓度会导至蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替。

(5)转移时间不够

对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间。

2、背景高


(1)膜没有完全均匀湿透

使用100% methanol浸透膜。

(2)洗膜不充分

增加洗液体积和洗涤次数。

(3)阻断不充分

增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等）。

(3)二抗浓度过高

降低二抗浓度。

(4)检测过程中膜干燥

保证充分的反应液，避免出现干膜现象。

(5)曝光过度

缩短曝光时间。

(6)抗体与阻断蛋白有交叉反应

检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应。

3、没有阳性条带


（1）抗体染色不充分

增加抗体浓度，延长孵育时间。

（2）酶失活

直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。

（3）标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。

（4）试剂不匹配

一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性。

（5）一抗失效

选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液。

（6）HRP抑制剂

所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。

4、有阳性条带，但条带比较弱


（1）抗体染色不充分

增加抗体浓度，延长孵育时间。

（2）酶活性降低

直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。

（3）标本中靶蛋白含量太低

增加标本上样量。

（4）洗膜过度

缩短洗涤时间。

（5）HRP抑制剂

所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。

（6）抗体活性降低

选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置。

（7）封闭过度

减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型。

（8）曝光时间过短

延长曝光时间。

（9）HRP抑制剂

所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。

5、条带位置（大小）不对；或有非特异性条带


（1）二抗的非特异性结合

增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的）。

（2）一抗的特异性不够

使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性。

（3）蛋白降解

使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂。

（4）二聚体或多聚体存在

增加蛋白质变性过程及强度。

（5）抗体浓度过高

降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带。

（6）蛋白上样量过大

降低上样量。

6、背景有斑点


（1）封闭剂中有聚集体

使用前过滤封闭试剂。

（2）HRP耦联二抗中有聚集体

过滤二抗试剂，去除聚集体。

7、膜上出现反像（暗背景上白色带）


（1）HRP含量过高

降低酶联二抗的浓度。