尿路感染是全球第二大常见感染，每年影响约4.05亿人，可发展为严重的肾盂肾炎和尿脓毒症，并造成严重的疾病负担和巨大的经济成本。在严重的尿路感染病例中，尽快使用有效的抗生素至关重要。传统诊断依赖于标准尿液培养，通常需要2至4天才能获得病原体鉴定和抗生素敏感性测试结果，这导至了基于经验性的广谱抗生素使用，加剧了抗菌素耐药性问题。 近日，来自德国和挪威的多个高校和机构共同在杂志Nature communications上发表了一篇题为“Metagenomic sequencing enables accurate pathogen and antimicrobial susceptibility profiling in complicated UTIs in approximately four hours”的文章。本研究开发了一种不依赖培养、直接作用于患者尿液样本的宏基因组测序工作流程（M + BB + NB），实现了从样本接收到临床决策的全过程约四小时完成的快速诊断。此方法在临床环境中对尿路感染的快速诊断准确率高，不仅有望显著改善复杂尿路感染患者的临床管理，也为在全球范围内推行更精准的抗菌药物管理、应对日益严峻的抗菌素耐药性挑战，提供了一个强有力的新型诊断工具。
图片来源：Nature communications 实验方法概述 作者开发了八种内部方法，旨在有选择性地清除宿主细胞并富集细菌群体（如下图）。内部方法使用皂苷联合盐激活核酸酶（SAN），包括HL_SAN（耐热盐激活的内切酶）和M_SAN（中等盐激活核酸内切酶），旨在选择性地裂解并降解宿主细胞（如白细胞、上皮细胞）的DNA，从而富集病原体DNA。作者还同时评估了三种商业检测试剂盒，Molysis Complete 5 (MC5)，Host Zero Microbial DNA extraction Kit (HZ)，以及Naxtra Blood Total Nucleic Acid Kit (NB)。作者重点测试了不同酶方案及增加酶解法（Lysozyme）和磁珠研磨法（Bead Beating）的改良，以提升对革兰氏阳性菌等的DNA回收效率。作者使用加标样本和临床尿液样本对这11种方法进行测试以及严格验证，所有临床样本的 mNGS 结果均与金标准MALDI-TOF质谱鉴定和VITEK-2系统进行了对比。
实验方法概述。图片来源：Nature communications 11种方法在病原体鉴定中性能的比较 研究结果显示，对于DNA提取产量而言，内部研发的方法在 DNA 产量方面与商业试剂盒表现相当，并且在与纳米孔测序的兼容性和准确性方面也与商业试剂盒相当。对于去宿主效率而言，M_SAN的去宿主性能表现略优于 HL_SAN。 mNGS测序结果（如下表）发现，采用中等盐激活核酸酶（M_SAN）结合珠磨法（BB）进行裂解，并使用Naxtra Blood磁珠法（NB）进行DNA提取的组合（M+BB+NB）表现最佳。这种方法的宿主DNA清除率高达10³倍，还同时能有效回收包括革兰氏阳性菌在内的各类病原体DNA。最优的M+BB+NB方法在 53 个样本中总体准确率得分达到 99%（100/101），正确识别了 88 种病原体，正确识别了 13 个阴性样本。三种商业方法病原体鉴定准确率为 81%（26/32），共有 25 种细菌和 1 个阴性样本被正确识别，但除了常规结果外，还发现了 6 个假阳性结果。这种方法的稳健性还体现在其能够以低至 32 个细菌细胞/微升的细菌浓度准确识别病原体，并且细菌与宿主细胞的比例极限低至 0.5。
三类方法的总体性能的概述。图片来源：Nature communications 11种方法在抗生素敏感性测试中性能的比较 未优化的内部方法和商业方法的准确率分别为 88%（200/226）和 76%（170/225）（下图 c ）。相比之下，最优的M+BB+NB方法整体AST准确率约 90%（589/653），特异性95%。M+BB+NB方法对常见尿路抗生素评估效果良好，尤其对青霉素类和磺胺类抗生素有较强预测能力。在多数抗药性机制，如多重外排泵 AcrAB-TolC、β-内酰胺酶变异 ampC的分析上与临床观察一致。
三类方法在抗生素敏感性测试中的性能。图片来源：Nature communications 流式细胞术数据和DNA 产量可预测培养阳性结果 测序数据表明，宿主读数中不到 1% 是线粒体 DNA，这表明线粒体和宿主基因组 DNA 都被有效去除。作者还进行了 AUROC 分析，评估了总 DNA 产量以及通过流式细胞术定量得出的细菌细胞数量是否能够作为区分培养阳性样本和培养阴性样本的预筛选指标。对 DNA 产量的分析结果显示，AUROC 值为 0.87（下图a）。其阳性预测值（PPV）为 0.97，阴性预测值（NPV）为 0.53。细菌细胞计数的AUROC 值为 0.90（下图 b），阳性预测值为 0.97，阴性预测值为 0.67。AUROC 值表明，这两个指标都是预测培养阳性结果的合理指标。
流式细胞术数据和DNA 产量可预测培养阳性结果。图片来源：Nature communications 最优方法的操作与成本优势突出 最优方法的整个流程包括宿主清除、DNA 提取、文库制备、纳米孔测序和实时分析，从样本接收到报告病原体结果其耗时约为4小时（如下图），测序实时分析2至25分钟内即可提供初步诊断，为急诊病例与感染危重患者争取了先机。整套分析成本仅约36美元/样本，相比购买同类产品成本降低30%。如进一步以流式细胞技术和DNA初筛（预测ROC为0.87）来预筛选是否值得全部核酸提取+测序，可将成本降至约6美元。
优化方法与常规方法检测病原体和抗性基因的时间线概述。图片来源：Nature communications 总结与讨论 在本研究中，作者旨在开发一种快速、选择性且成本效益高的基于宿主清除的宏基因组样本制备、纳米孔测序和数据分析工作流程，用于分析尿路感染样本。对八种内部方法和三种商业方法进行了比较，发现一种采用中等盐激活核酸酶（M_SAN）结合珠磨法（BB）进行裂解，并使用Naxtra Blood磁珠法（NB）进行DNA提取的组合（M+BB+NB）方法表现最佳。 所开发的宿主清除方法的一个局限性在于它们无法检测真菌病原体。真菌细胞膜因含有甾醇，更容易受到皂苷的影响以及随后的渗透性压力。因此，改进后的方法应有助于检测真菌病原体。此外，本研究纳入样本数有限，仍需扩大到更大临床队列中进行更多样本地域/性别差异考量。总之，本研究证明了优化的 DNA 提取方法（M + BB + NB）在临床环境中对尿路感染的快速诊断具有有效性，不仅有望显著改善复杂尿路感染患者的临床管理，特别是对于尿脓毒症等危重情况，也为在全球范围内推行更精准的抗菌药物管理、应对日益严峻的抗菌素耐药性挑战，提供了一个强有力的新型诊断工具。 |
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