SNP分型检测技术有那些？

一、基于电泳的检测方法

1. PCR-RFLP：

限制性片段长度多态性 PCR，是理论依据是首先利用 PCR 扩增目的基因，然后用限制性内切酶酶解样品 DNA，产生大量的限制性酶切片断。将限制性酶切产物进行含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下即可分辨各种限制性片段的大小及其位置。或者将限制性酶切产物与探针杂交进行放射自显影，从而区分各种片段。

2.PCR-SSCP

PCR-SSCP是1989年日本Orita等创建的筛查突变的新技术。它是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段。

PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象，其构象直接影响泳动速率，相同长度的DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同，产生不同的泳动带。

PCR扩增后的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳，与正常比较出现泳动带的变位即可推测存在碱基置换。其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。因此PCR-SSCP检测是测序之前突变筛查的常用手段。 

为了便于观察分析结果，PCR扩增体系中常加入a-32P dNTP标记PCR产物，电泳后放射自显影观察泳动带的位置。目前也常用银染法来染色聚丙烯酰胺凝胶上的DNA泳动带，此方法可避免同位素的污染及对操作者的辐射损伤，但其灵敏度不如用同位素标记。

3.AS-PCR

等位基因特异性 PCR 的基本原理是，Taq DNA 聚合酶缺少外切酶活性，在一定条 件下，PCR 引物 3' 末端的错配导至产物的急剧减少，针对不同的已知突变，设计适当的引物， 可以通过 PCR 方法直接达到区分突变型与野生型基因的目的。

该方法要求制备 3个PCR 引物， 其中 2 个引物分别含有待测 DNA 中突变位点的突变碱基及正常碱基，另外一个为正常对侧引物。当分别经过 PCR 扩增后，正常引物仅将正常 DNA 扩增出，而含突变碱基的引物将突变 DNA 链扩增出，然后用普通琼脂糖凝胶电泳检测有无扩增产物。

二、基于荧光定量PCR的检测方法

1.TaqMan探针法：

TaqMan探针是一种双标记、自淬灭的水解探针，在PCR反应中加入两条两端带有不同荧光标记的特异探针来识别不同的等位基因。其5’和3’末端分别标记荧光基团和淬灭基团，在探针结构完整时两者距离较近，荧光基团的信号可被淬灭。

而在PCR扩增过程中，若TaqMan探针与靶标序列完全匹配，探针则可结合在DNA模板上，此时Taq酶延伸至探针位置时，其外切酶活性将切割水解探针，释放荧光基团，使得荧光信号增强。而且，随着扩增产物的增多，荧光信号越来越强，从而可通过仪器实时监测荧光信号的变化过程。

TaqMan探针法相对而言，方法成熟、操作便捷，体系/平台相对开放，临床端认可度高，在注册文件审核等方面更有优势，是最常见的SNP分型方法之一；但是其也有不可忽视的限制性，如每个位点需要两条探针，探针价格昂贵，因此TaqMan探针法通常用于少量SNP位点大量样本的分析，且对于近距离SNP位点探针设计也是比较困难的。

2.HRM法

HRM(High Resolution Melting analysis，高分辨熔解曲线)同许多荧光PCR技术一样，是利用特定dsDNA染料可以插入DNA双链小沟中（PCR产物）的特性，通过实时监测升温过程中dsDNA解链，荧光染料脱落，荧光信号减弱或消失的过程，高分辨记录熔解曲线，从而对样品进行检测。

三、直接测序法

1.一代测序：

将待检测片段（包含待测SNP位点）进行PCR扩增并直接进行测序是SNP检测方法中最准确的一种，堪称SNP分型的“金标准”。获得测序峰图，纯合位点为单峰，而杂合位点则为套峰，因此通过查看测序峰图很容易将基因型区分开来。直接测序法不仅可用于对已知位点的检测，还可用于发现未知的SNP位点。 

2.二代测序：

随着二代测序技术的普及，相比Sanger测序，以降低测序读长的前提，大大增加的测序通量同时大幅降低测序成本。利用二代测序进行SNP分型，不仅测序读长满足分型需求，可以同时对数十数百个位点，上千样本进行分型。该方法相比直接测序法，除了保留测序法的优点外，弥补了其通量不足的限制，二代测序分型法也正在快速在领域内推广。

该方法利用多重PCR技术，同时捕获数十上百个SNP位点，Barcode引物区分不同样本，实现一次上机测序，完成多位点，大样本的高通量分型实验目的。多重PCR特性，也大大降低了对样本量的需求。

四、其它检测方法

1.质谱方法

质谱法是基于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）的检测方法，

原理及操作如下：

(1) 通过PCR扩增含有SNP的目的片段（SNP位点前后约50 bp的片段）；

(2) 使用虾碱性磷酸酶（SAP）去除体系中的底物及引物，加入单碱基延伸引物（3’末端与SNP位点前一碱基互补）和ddNTP；

(3) 得到3’末端ddNTP与SNP位点等位基因对应的产物片段，则产物片段仅比单碱基延伸引物多一个与SNP互补的ddNTP；

(4) 飞行质谱检测产物片段分子量，与单碱基延伸引物比较即可获得SNP位点的碱基信息。

该法第一步中PCR产物在进行单碱基延伸前需要先纯化，单碱基延伸产物在质谱上机前也需要纯化，操作较复杂，多用于医学领域。

2.SNaPshot技术

SNaPshot技术是由美国应用生物公司（ABI）开发的中等通量SNP分型技术，其核心原理为荧光标记单碱基延伸，可在单次反应中实现10-50个SNP位点的同步检测，分型准确率达99.99%.

SNaPshot技术基于荧光标记单碱基延伸原理，通过多重PCR扩增目标区域DNA后，在单碱基延伸反应中使用测序酶、四种荧光标记ddNTP及长度差异化的延伸引物，使引物延伸一个碱基后终止。不同SNP位点的延伸产物因引物长度与荧光标记差异，经ABI测序仪检测后形成独立信号峰，通过分析峰值颜色与位置完成基因分型。

技术流程

（1）多重PCR扩增：设计14个SNP位点的特异性引物，优化浓度避免扩增干扰，生成目标DNA片段。

（2）产物纯化：使用虾碱性磷酸酶（SAP）降解残留dNTP及引物，提升后续反应特异性。

（3）单碱基延伸：采用ABI SNaPshot Multiplex Kit，在96℃预变性后执行28次温度循环（96℃/55℃/60℃），使延伸引物与模板结合并掺入荧光ddNTP 。

（4）产物分析：延伸产物经Hi-Di甲酰胺变性，与120 LIZ® Size Standard混合后，通过ABI3730XL测序仪读取荧光信号及片段长度。

3.LDR法

主要应用连接酶检测反应 (ligase detection reaction，LDR)技术。即在Taq DNA连接酶的作用下, 当左右两条寡核苷酸探针与目的DNA序列完全互补，并且两条探针之间没有空隙时才能发生连接反应，否则连接反应不能进行，最后通过荧光扫描片段长度，根据测序峰移动的胶位置，通过末端未标记探针的3个碱基差异，确定同一位点的不同基因型，再通过末端未标记探针的7个碱基差异，确定不同位点，最终实现对SNP 位点的精确检测。

PCR-LDR技术流程：

1. 多重PCR扩增：获得目标位点所在的片段；

2. 多重LDR：得到长度各异的检测产物；

3. 3730测序仪检测：根据测序电泳得到不同的峰值；

4. 判断SNPs结果，数据分析；