核酸，包括DNA和RNA，经常发生突变和修饰，可导至人类疾病。RNA在生物体内不仅负责遗传信息的传递，还参与基因表达的调控。然而，RNA突变和修饰可能导至多种疾病，包括癌症和抗菌素耐药性。因此，开发可靠的方法来检测RNA的单核苷酸突变和修饰显得尤为重要。近年来，尽管已有多种技术用于RNA检测，如单链构象多态性、变性高效液相色谱、液相色谱-质谱和蛋白质辅助测定等，但这些方法存在灵敏度有限、间接读数、工作流程复杂以及需要预先扩增或标记等局限性。此外，下一代测序技术虽然已成为单核苷酸多态性（SNP）图谱绘制的金标准，但其高错误率、大样本需求、RNA降解风险以及对复杂计算管道的依赖限制了其广泛应用。 为了克服这些挑战，研究人员提出了一种基于固态纳米孔的新型RNA检测方法——RNA单核苷酸表征和分析纳米锁扣（RNA-SCAN）系统。该系统结合了RNA/DNA杂化纳米技术和纳米孔传感技术，实现了对复杂RNA结构中单核苷酸变化的高灵敏度检测。作为概念验证，作者成功地利用大肠杆菌和沙门氏菌16S rRNA的核苷酸变异，从总RNA中区分出了大肠杆菌和沙门氏菌，并对不同沙门氏菌进行了定量分析，还检测了大肠杆菌16S rRNA上的m5C1407修饰。RNA-SCAN方法证明了将RNA/DNA混合纳米技术与纳米孔传感和诊断RNA相关健康状况相结合的可行性。
图片来源：Nature nanotechnology 主要内容 RNA-SCAN的工作原理概述 RNA-SCAN系统的工作原理基于纳米孔测量和DNA纳米结构的可编程性。首先，目标RNA分子“支架”与设计的DNA寡核苷酸杂交，形成稳定的RNA/DNA双链，这一步骤不仅保护了RNA免受降解，还有助于展开其天然结构。接着，研究人员在载体上设计了邻近靶点的overhang结合位点，用于招募带有互补序列的DNA发夹探针（即“纳米锁扣”）。纳米锁扣通过toehold介导的链置换反应与载体结合，形成一个不稳定的环结构。这个环结构的状态（锁定或未锁定）取决于纳米锁扣与目标位点的碱基配对强度，并在纳米孔测量中表现为不同的离子电流模式。 RNA-SCAN对单核苷酸变异的敏感性源于靶位点精细的竞争杂交机制（如下图）。具体来说，每个目标位点都被设计成一个10-nt配对区域和一个相邻的8-nt竞争区域。当组装载体时，竞争区域由DNA寡核苷酸互补，而配对区域保持单链，以便纳米锁扣结合。这种策略设计使纳米锁扣或互补DNA寡核苷酸竞争性与RNA结合。当RNA序列与纳米锁扣完全匹配时，产生锁定环结构，称为“正事件”。错配会使平衡倾向于互补DNA寡核苷酸，减少正事件的发生率。
RNA-SCAN的工作原理概述。 图片来源：Nature nanotechnology 检测单核苷酸突变以及核苷酸修饰 为了验证RNA-SCAN系统检测单核苷酸突变的能力，研究人员使用了MS2 RNA作为模型载体支架，并设计了携带特定碱基变化的合成纳米锁扣。结果显示，即使单个核苷酸的错配也会显著降低纳米锁扣与RNA的结合亲和力，导至锁定环结构的形成减少，导至正事件比率的下降（如下图）。这一发现证明了RNA-SCAN系统对RNA序列中细微变化的高度敏感性。 除了检测突变外，RNA-SCAN系统还能够检测具有不同生物物理效应的核苷酸修饰。例如，5-甲基胞嘧啶（5mC）和2′-O-甲氧基乙基胞嘧啶（MeC）修饰增强了C/G碱基配对，从而增加了环结构的形成和正事件比率。相反，胞嘧啶和腺苷的去氨基化（分别形成尿嘧啶和肌苷）破坏了典型的碱基配对，降低了信号输出。这些结果表明，RNA-SCAN系统能够敏感地检测由核苷酸修饰引起的结构变化。
在纳米锁扣上检测核苷酸突变。 图片来源：Nature nanotechnology 应用RNA-SCAN技术鉴别大肠杆菌和伤寒沙门氏菌 为了评估RNA-SCAN系统在天然长RNA分子上的性能，研究人员将其应用于区分大肠杆菌（E. coli）和伤寒沙门氏菌（S. Typhi）这两种革兰氏阴性细菌。首先确定了大肠杆菌和伤寒沙门氏菌16S rRNA之间含有单核苷酸差异的一个18 nt区域，并作为RNA-SCAN检测的目标（图b），设计特定变体的纳米锁扣。结果显示，RNA-SCAN系统成功地在未经过进一步纯化或富集的细菌总RNA中区分了这两种细菌。这一发现展示了RNA-SCAN系统在实际应用中的潜力，如微生物鉴定和耐药性分析。
RNA-SCAN技术鉴别大肠杆菌和伤寒沙门氏菌。 图片来源：Nature nanotechnology 不同血清型沙门氏菌16S rRNA变异的定量分析 为了进一步展示RNA-SCAN系统的定量能力，研究人员设计了针对不同血清型的肠炎沙门氏菌S. Typhi和S. Enteritidis 16S rRNA保守区域的寡核苷酸库，并利用两个血清型之间三个连续的核苷酸差异设计纳米锁扣来区分和量化这两种沙门氏菌RNA的混合物（下图f）。纳米孔测量结果显示，正事件比率与混合物中每种目标RNA的比例呈线性关系，从而验证了RNA-SCAN系统在高度相似序列间的区分和定量能力（下图h）。这一发现为混合样品中的多重病原体量化提供了可能。
不同血清型沙门氏菌16S rRNA变异的定量分析。 图片来源：Nature nanotechnology 大肠杆菌和鲍曼不动杆菌16S rRNA中m5C的检测 除了序列变异外，研究人员还评估了RNA-SCAN系统检测内源性长RNA中核苷酸修饰的能力。他们选择了大肠杆菌16S rRNA中的m5C1407修饰作为检测目标，并使用鲍曼不动杆菌（A. baumannii）作为未甲基化的对照。作者设计了物种特异性的寡核苷酸库来组装RNA载体，同时使用了一种针对C1407区域的通用纳米锁扣（图b，c）。纳米孔测量结果显示，与A. baumannii相比，大肠杆菌产生了更高的正事件比率，这归因于m5C修饰增强了纳米锁扣的结合。
大肠杆菌和鲍曼不动杆菌16S rRNA中m5C的检测。 图片来源：Nature nanotechnology 总结与讨论 本研究开发的RNA-SCAN系统是一种基于纳米孔的单分子检测技术，能够在无需扩增或标记的情况下对长RNA分子进行序列特异性分析。通过结合可编程DNA纳米结构和玻璃纳米孔传感技术，RNA-SCAN系统将RNA序列中的细微变化转化为二进制信号输出，实现了对单核苷酸变化的高特异性检测。此外，该系统还能够敏感地检测具有不同生物物理效应的核苷酸修饰，并在复杂RNA背景中区分和量化高度相似的序列。 尽管RNA-SCAN系统具有许多优点，但其当前平台仍面临一些限制，如单次运行只能检测单个目标、通量受限等。未来，通过开发并行化多纳米孔阵列和多重纳米锁扣设计，有望进一步提高RNA-SCAN系统的通量和内容分析能力。随着便携式、高通量纳米孔设备的不断成熟，RNA-SCAN系统有望成为检测临床上相关RNA序列变异和修饰的点对点平台，特别是在传染病诊断、癌症监测和表观转录组学研究中发挥重要作用。总之，RNA-SCAN系统不仅为RNA检测提供了一种具体的分析解决方案，还为纳米级分子检测提供了一种通用的设计原则。这一技术的进一步发展有望为生物医学研究和临床诊断带来革命性的变化。 |
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